ИЗВЕСТИЯ РАИ. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2008, № 6, с. 688-695 ^=МИКРОБИОЛОГИЯ
УДК 579.8+597.556
ТАКСОНОМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА МИКРООРГАНИЗМОВ ИЗ КИШЕЧНИКА
ЩУКИ (Esox lueius)
© 2008 г. Г. И. Извекова*, Н. В. Немцева**, А. О. Плотников**
*Институт биологии внутренних вод им. И.Д. Папанина РАИ, 152742 Ярославская обл., пос. Борок **Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАИ, 460000 Оренбург, ул. Пионерская, 11
E-mail: izvekov@ibiw.yaroslavl.ru Поступила в редакцию 08.08.2007 г.
Установлены таксономический состав и распределение микроорганизмов, ассоциированных со слизистой кишечника шуки Esox lucius. В составе кишечной микрофлоры доминировали представители семейств En-terobacteriaceae, Aeromonadaceae, Vibrionaceae. Виды бактерий, преобладающие по численности, характеризуются высокими уровнями ферментативной активности (протеолитической и амилолитической) и перси-стентных свойств (антилизоцимной и антигистоновой активностей). Полученные данные позволяют рассматривать Hafnia alvei, Yersinia ruckeri, Vibrio vulnificus и V. furnissii, Aeromonas salmonicida, Shewanella putrefaciens в качестве представителей нормальной микрофлоры кишечника шуки.
Достаточно много работ посвящено количественному и качественному составу кишечной микрофлоры позвоночных животных и, в частности, рыб (Лубянскене и др., 1989; Cahill, 1990; Clements, 1997). В кишечнике пресноводных рыб встречаются представители энтеробактерий (Citrobacter freundii, Enterobacter spp., Escherichia spp., Hafnia alvei, Klebsiella spp., Proteus spp., Serratia spp.), неферментирующие глюкозу грамотрицатель-ные бактерии (Acinetobacter spp., Alcaligenes spp., Moraxella spp., Pseudomonas spp.), грамположи-тельные бактерии (Bacillus spp., Listeria spp., Staphylococcus spp.), облигатные анаэробные бактерии (Bacteroides spp., Propionibacterium spp.), представители группы Cytophaga/Flexibacter и др. (Cahill, 1990; Austin, 2002). В то же время видовой состав кишечной микрофлоры щуки практически не исследован. В содержимом кишечника щук найдены Pseudomonas spp., Bacillus spp. и бактерии, относящиеся к группе Coryneforms (неспоро-образующие факультативно анаэробные грампо-ложительные палочки, в настоящее время относятся к нескольким родам, преимущественно семейства Corynebacteriaceae) (Кузьмина, Сквор-цова, 2002).
Бактерии играют важную роль в питании рыб, продуцируя основные жирные кислоты, витамины, минеральные вещества и ферменты (Hansen, Olafsen, 1999). Исследования состава кишечной микрофлоры пресноводных рыб преимущественно касаются видов, разводимых в прудовых хозяйствах (Cahill, 1990; Austin, 2002), тогда как аналогичные работы на хищных представителях континентальной ихтиофауны единичны (Кузьмина, Скворцова, 2002).
Большой интерес в теоретическом и практическом аспектах представляют механизмы, обеспечивающие взаимодействие кишечных бактерий со слизистой оболочкой и тем самым способствующие их персистенции, т.е. длительному сохранению. В качестве подобных механизмов можно рассматривать участие бактерий в трофической системе сообщества (Заварзин, 1992; Извекова, 2005), антагонистические эффекты бактерий, участвующие в формировании колонизационной резистентности (Бухарин, 1999), устойчивость к антибактериальным веществам, продуцируемым макроорганизмом (Hooper et al., 1998; Бухарин, 1999). В то же время механизмы персистенции бактерий в кишечнике рыб изучены недостаточно.
В связи с этим цель работы заключалась в исследовании видового разнообразия и физиологических свойств кишечной микрофлоры, способствующей персистенции бактерий в кишечнике рыб, на примере щуки Esox lucius.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалом для исследования была слизистая оболочка кишечника щуки (Esox lucius) - широко распространенного вида рыб, обитающего в Рыбинском водохранилище. Серозную поверхность кишечника однократно обрабатывали 70%-ным спиртом, подсушивали стерильной марлевой салфеткой и вскрывали полость кишечника в асептических условиях. Смывы с кишечника щуки для дальнейших микробиологических посевов получали, используя схему методов последовательной десорбции ферментов с отрезков кишки (Кузьмина,
ТАКСОНОМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА 689
1976). Отрезки кишечника помещали в колбу со стерильным раствором Рингера (10 мл) для холоднокровных животных (рН 7.4) и встряхивали. Затем отрезки кишки последовательно переносили в другие колбы с раствором Рингера и повторяли встряхивание. Первую фракцию Д1 получали после 30-секундного встряхивания, остальные -Д2-Д5 - через каждые последующие 15 мин. Указанные фракции содержат микроорганизмы, которые постепенно смываются с поверхности слизистой в зависимости от степени ассоциирования со слизистой кишечника и от глубины расположения. Таким образом, в ряду Д1-Д5 прочность ассоциации бактерий с поверхностью кишечника возрастает, а полученные фракции соответствуют распределению микрофлоры в кишечнике -от полостной во фракциях Д1-Д2 до глубинной (пристеночной) во фракциях Д3-Д5. Для микробиологических исследований использовали фракции Д1, Д3, Д5 и гомогенат слизистой оболочки, полученный путем растирания фрагмента слизистой кишечника с 9-кратным (вес/объем) количеством раствора Рингера в стерильной ступке.
Чистые культуры бактерий получали путем посева 0.1 мл неразведенной и разведенных в 10, 100 и 1000 раз проб на твердые питательные среды: "голодный" агар, кровяной агар, 1.5%-ный мясо-пеп-тонный агар, висмут-сульфит агар, среду Эндо, среду Плоскирева. Чашки Петри с питательными средами инкубировали при 25-37°С в течение 3 сут, затем производили подсчет выросших колоний разных типов. Видовую идентификацию выделенных штаммов осуществляли, используя Определитель бактерий Берджи (Berkeley et al., 1994) и Определитель нетривиальных патогенных грамотрицатель-ных бактерий (Weyant et al., 1996) на основании морфологических, тинкториальных, культуральных и биохимических свойств с применением планшетных тест-систем "ENTEROtest" и "NEFERMtest" (LACHEMA, Чехия).
Продукцию гидролитических ферментов микроорганизмами оценивали на жидких питательных средах следующего состава: для определения про-теолитической активности - 3.5 г сухого рыбо-пеп-тонного бульона на 1 л раствора Рингера; для определения амилолитической активности - 3.5 г рыбо-пептонного бульона и 10 г растворимого крахмала на 1 л раствора Рингера. Среды, иноку-лированные микроорганизмами, культивировали в течение 3 сут при температуре 25°С, после чего в них определяли активность ферментов бактерий. Общую амилолитическую активность определяли модифицированным методом Нельсона (Уголев, Иезуитова, 1969), общую протеолитическую активность - методом Ансона (Anson, 1938). Интенсивность развивающегося окрашивания, пропорционального активности ферментов, измеряли на спектрофотометре СФ-46.
Антилизоцимную активность микроорганизмов определяли чашечным методом по зонам стимуляции роста индикаторной культуры Micrococcus lu-teus (штамм депонирован под № 2665 в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов III—IV групп ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича Роспотребнадзора РФ, Россия) над колониями исследуемых штаммов, выращенных на среде с яичным лизоцимом ("Мосмедпрепараты" им. Л.Я. Карпова, Россия) (Бухарин, 1999). Величину антилизо-цимной активности микроорганизмов выражали в мкг инактивированного лизоцима на 1 мл среды. Антигистоновую активность микроорганизмов определяли методом фотометрической регистрации степени задержки роста индикаторного штамма M. luteus после его инкубации с супернатантом исследуемой культуры и препаратом общей фракции гистонов из тимуса теленка (Sigma, США) (Бухарин и др., 2003).
Полученные результаты обрабатывали статистически. Для средних величин рассчитывали стандартное (среднеквадратическое) отклонение, достоверность коэффициентов корреляции оценивали с помощью критерия Стьюдента при уровне значимости р = 0.05 (Лакин, 1990).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Бактериологическим методом из полученных фракций выделено 86 штаммов, принадлежащих к 9 видам гетеротрофных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов. Восемь видов относятся к бактериям различного таксономического положения и один вид Cryptococcus neoformans - к эукариотическим грибам. Все виды бактерий представляют собой грамотрицательные микроорганизмы класса Gammaproteobacteria, семейств Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Aero-monadaceae, Vibrionaceae, Alteromonadaceae. Из всех фракций выделено по пять видов бактерий, за исключением гомогената кишечной слизистой, в котором обнаружено шесть видов. Видовой состав бактерий в различных фракциях отражает особенности распределения микрофлоры в кишечнике. H. alvei, Shewanella putrefaciens, представители рода Vibrio обнаружены во всех исследованных фракциях (Д1, Д3, Д5) и в гомогенате слизистой. Бактерии рода Aeromonas присутствуют во фракциях Д3, Д5 и в гомогенате. Yersinia rucken и C. neoformans выделены только из легко смываемой фракции Д1, а Chryseomonas luteola - напротив, только из гомоге-ната слизистой кишечника.
Численность бактерий значительно снижается от просвета кишечника (фракция Д1) к пристеночной кишечной фракции Д5. Так, если во фракции Д1 численность микроорганизмов составила 3.6 х 106 КОЕ/мл, то во фракции Д3 жизнеспособных бактерий уже меньше - 1.94 х 106 КОЕ/мл. Во фракции Д5, соответствующей глубинной (присте-
Таблица 1. Видовой состав и численность бактерий в смывах с кишечника (фракции Д1, Д3, Д5) и в гомогенате слизистой оболочки кишечника щуки
Вид микроорганизма Численность микроорганизмов, КОЕ/мл
Д1 Д3 Д5 гомогенат
Enterobacteriaceae
Hafnia alvei 1.85 х 106 1.45 х 106 1 х 104 8 х 103
Yersinia ruckeri 1.3 х 106 0 0 0
Vibrionaceae
Vibrio vulnificus 0 2.3 х 105 0 4.1 х 102
Vibrio furnissii 4 х 105 2.3 х 105 5.6 х 102 5.7 х 102
Aeromonadaceae
Aeromonas hydrophila 0 40 8 х 102 0
Aeromonas salmonicida 0 0 2.5 х 103 2.5 х 102
Alteromonadaceae
Shewanella putrefaciens 1 х 104 3 х 104 3 х 102 5.5 х 102
Pseudomonadaceae
Chryseomonas luteola 0 0 0 5
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.