ПОЧВОВЕДЕНИЕ, 2015, № 3, с. 308-316
БИОЛОГИЯ ПОЧВ
УДК 631.468:631.86.:631.445.2:631.452
ТАКСОНОМИЧЕСКИЙ СОСТАВ И ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БАКТЕРИЙ ПИЩЕВАРИТЕЛЬНОГО ТРАКТА
ДОЖДЕВЫХ ЧЕРВЕЙ*
© 2015 г. Б. А. Бызов1, В. В. Тихонов1, Т. Ю. Нечитайло2, В. В. Демин3, Д. Г. Звягинцев1
1Факультет почвоведения МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991, Москва, Ленинские горы
e-mail: byzovba@gmail.com 2Институт Макса Планка по химической экологии, 07745, Йена, Германия е-mail: tnechitaylo@ice.mpg.de 3Институт экологического почвоведения МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Ленинские горы
е-mail: vvd@ps.msu.ru Поступила в редакцию 02.06.2014 г.
Из почвы и пищеварительных трактов почвенных и навозных дождевых червей изолированы и идентифицированы несколько сотен штаммов бактерий, принадлежащих к разным таксонам, а также охарактеризованы некоторые их физиолого-биохимические свойства. Установлено, что большинство штаммов кишечных бактерий червей является факультативными анаэробами. Кишечные изоляты бактерий обладали повышенной, по сравнению с почвенными, активностью протеаз и де-гидрогеназ. Кроме того, бактерии, ассоциированные с кишечниками червей, способны к росту на гуминовой кислоте как на единственном источнике углерода; при этом гуминовая кислота стимулировала рост кишечных бактерий больше, чем почвенных, а в самих пищеварительных трактах обнаружена полифенолоксидазная активность. В совокупности с данными о таксономической обособленности кишечных бактерий, описанные признаки свидетельствуют о наличии в кишечнике червей группы бактерий, которая функционально характерна для кишечника червей и отличается от почвенных бактерий.
Ключевые слова: кишечник, симбионты, ферментативная активность, гуминовые кислоты, разложение, стимуляция роста.
DOI: 10.7868/S0032180X1503003X
ВВЕДЕНИЕ
Дождевые черви имеют огромное значение для функционирования наземных экосистем и процессов почвообразования. При этом важны не только черви per se, но и микробиота, ассоциированная с кишечником этих животных, которая, вероятно, имеет большое значение в процессах разложения и круговорота веществ в природе. Наличие у дождевых червей микроорганизмов, специфически ассоциированных с пищеварительным трактом, до сих пор не доказано. Существует мнение, что в пищеварительном тракте червей обитают те же микроорганизмы, что и в почве. Даже выделение из кишечника бактерий из семейства Vibrionaceae [21], не свойственных собственно почве, не обеспечивало доказательства специфичности сообщества. Ранее методом сканирующей электронной микроскопии было
* Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ № 11-04-00580а, 12-04-01652а, РФФИ № 12-0431720 мол_а и гранта Президента РФ МК-5939.2013.4.
показано наличие тонких гиф бактериальных размеров, вросших в эпителий кишечников червей ЬитЪпсш 1еггезМз и ОсЫазюп суапеит [14]. Недавно в кишечнике и целомической жидкости дождевых червей была обнаружена группа не-культивируемых прокариот Сапй1йаШ$ ЬишЪйст-со1а из класса МоШси1е8, который включает в себя строго симбиотических бактерий растений, членистоногих и позвоночных животных и человека (например, микоплазмы, уреаплазмы) [17]. И хотя эти бактерии были ассоциированы только с червями, невозможно утверждать, что кишечник червей является их специфической средой обитания. В то же время показано, что культивируемые бактерии из очищенных от пищи пищеварительных трактов таксономически отличаются от тех, которые выделяются из субстратов обитания червей: почв и компостов [1, 13, 23]. Анализ бактериальных сообществ почв и экскрементов червей с помощью методов молекулярной микробиологии подтвердил, что условия кишечника дождевых червей стимулируют увеличение численности и
таксономического разнообразия специфических бактерий [18].
Имеются некоторые сведения о свойствах микробных группировок пищеварительных трактов червей. Бактерии червей представлены факультативно-анаэробными бактериями [3, 7, 21]. Пищеварительный тракт червей — микроаэрофильная и даже анаэробная микрозона в почве, в которой активизируются процессы денитрификации и де-токсикации нитритов, которые осуществляют бактерии, а также азотфиксации [12, 15, 16, 21]. Бактерии могут реутилизироваться в кишечнике и, тем самым, снабжать организм хозяина белком, незаменимыми аминокислотами [19] и жирными кислотами [20]. Функциональная роль этих микроорганизмов может состоять и в их способности продуцировать ферменты, необходимые для разложения целлюлозы, гемицеллюлозы и иных природных полимеров [9, 11, 24, 25], а также гумино-вых кислот [22]. Обнаружено, что кишечные изо-ляты актинобактерий обладают повышенной антибиотической активностью по сравнению с почвенными, что может быть защитной функцией кишечного микробного сообщества, повышающей устойчивость кишечника к колонизации чужеродными микроорганизмами [4].
Эти факты вместе с новыми сведениями, представленными в данной работе, позволят сформировать физиолого-биохимический "портрет" бактериального сообщества пищеварительного тракта дождевых червей. Представляется, что дополнительным критерием для выделения такой группы бактерий, для которых условия кишечников являются благоприятными, должны быть особые характерные для этого местообитания физиолого-биохимические свойства и, как следствие, специфические экологические функции в организме-хозяине и в природе.
Цель работы — выявить особенности таксономического состава и физиолого-биохимические свойства культивируемых бактерий из кишечников дождевых червей в сравнении с бактериями из почвы и экскрементов для получения дополнительных доказательств принадлежности их к тесно ассоциированным с кишечником червей. Сравнивали рост бактерий в микроаэрофильных условиях, протеолитическую, дегидрогеназную и фенолоксидазную активности, способность бактерий расти на гуминовых кислотах (ГК) как единственном источнике углерода и модифицировать их структуру, а также возможность ГК стимулировать рост бактерий.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ
Дождевые черви. Исследовали дождевых червей из разных эколого-трофических групп: почвенного — Aporrectodea caliginosa (Sav.) и нор-
ного — Lumbricus terrestris (L.), обитающих в окультуренной дерново-подзолистой почве под бобово-злаковой растительностью. Работы проводили в Почвенно-экологическом центре МГУ "Чашниково" (Московская обл.). Содержание углерода органического вещества в почве составляет 1.72%, азота — 0.13%, pH водной вытяжки — 5.7. Также использовались компостные черви Eisenia fetida andrei (Bouche, 1972) породы "Русский Московский гибрид", любезно предоставленных А.Б. Абдуразаковым, ООО "РОСТА-ГРОЭКОЛОГИЯ" (пос. Пирогово).
Очистка и выделение пищеварительных трактов червей, их копро-литов и получение кишечной жидкости. Образцы свежих копролитов получали, выдерживая червей в чашках Петри на увлажненной стерильной фильтровальной бумаге при температуре 4—5°C в течение нескольких часов. Затем для более полной очистки пищеварительных трактов червей от пищи (почвы или компоста) их содержали на влажной фильтровальной бумаге или на стерилизованном прокаливанием влажном песке в течение 5—7 сут при 5—7°C. Степень очистки пищеварительного тракта оценивали по наличию внутри тела червя темных частиц. Для выделения кишечников очищенных от пищи червей вскрывали на морозильном столике (элемент Пелтье, —16°C) во время оттаивания. При этом не допускали повторного замораживания—оттаивания. Вырезали участок пищеварительного тракта в области пояска. Для получения кишечной жидкости очищенные от остатков корма пищеварительные тракты измельчали и центрифугировали при 12000 об./мин в течение 10 мин. Надосадоч-ную жидкость забирали, повторно центрифугировали и фильтровали через фильтр 0.22 мкм для отделения основной части бактерий. Стерильность проверяли, высевая профильтрованную жидкость на питательную среду. Кишечную жидкость хранили при температуре —18°С [8]. Копролиты, почвы и компосты хранили при естественной влажности в холодильнике при +2°C не более недели.
Бактерии. Использовали бактерии, выделенные из почвы (компоста), очищенных пищеварительных трактов и свежих экскрементов червей на среду R2A (г/л): дрожжевой экстракт — 0.54; протеозный пептон — 0.5; гидролизат казеина — 0.5; глюкоза — 0.5; растворимый крахмал — 0.5; натрий виннокислый — 0.3; калий фосфорнокислый двузамещенный — 0.3; магний сернокислый — 0.05; агар Difco — 12. Бактерии идентифицировали по морфо-физиологическим и молекулярно-гене-тическим признакам с помощью ПЦР-амплифи-кации генов 16S рРНК с последующим секвени-рованием ампликонов и анализом данных [8] (табл. 1). Между экспериментами бактерии хранили в жидкой среде R2A с 25% глицерина при —18°C или —80°C.
Таблица 1. Бактерии, использованные в работе (в скобках дано количество штаммов)
Класс Почва, компост Кишечник, экскременты
Actinobacteria (58*) Agromyces spp. (2) Microbacterium sp. (4)
Arthrobacter spp. (4) Rhodococcus spp. (1)
Kocuria palustris (5) Streptomyces spp. (1)
Microbacterium sp. (1)
Nocardioides spp. (5)
Rhodococcus spp. (1)
Streptomyces spp. (4)
Alphaproteobacteria (20) Aminobacter aminivorans (2) Ochrobactrum grignonense (1)
Sphingopyxis spp. (2)
Bacilli (84) Bacillus spp. (16) Bacillus spp. (2)
Paenibacillus sp. (1)
Betaproteobacteria (27) Oxalobacter sp. (1) Buttiauxella spp. (5)**
Flavobacteria (5) Chryseobacterium spp. (2)**
Gammaproteobacteria (129) Pseudomonas spp. (11) Acinetobacter sp. (4)**
Aeromonas pp. (16)**
Delftia acidovorans (4)
Pseudomonas spp. (12)
Shewanella sp. (1)
Sphingobacteria (4) Sphingobacterium spp. (2)**
* Идентифицированы только до уровня класса; всего использовано 511, идентифицированы до рода (вида) 91 изолят. ** Факультативно-анаэробные бактерии.
Измерение роста бактерий. Культуры бактерий выращивали в 96-луночных планшетах на качалке TITRAMAX 1000 (Heidolph) в жидких средах R2A или Чапека—Докса при 120 об./мин. Автоматически в динамике измеряли оптическую плотность суспензий при 492 или 620 нм на микропланшетном спектрофотометре TECAN (Sunrise).
Способность кишечных бактерий к росту в микроаэро фи
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.