БИОФИЗИКА, 2015, том 60, вып. 5, с. 877-882
МОЛЕКУЛЯР НАЯ БИОФИЗИКА
УДК 577.323.7
ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ПЕРСПЕКТИВЫ СОЗДАНИЯ ДНК-МОДИФИЦИРОВАННЫХ БИОЛОГИЧЕСКИХ СЕНСОРОВ НА ОСНОВЕ УГЛЕРОДНЫХ НАНОТРУБОК
© 2015 г. И.А. Комаров, И.И. Бобринецкий, А.В. Головин*, А.О. Залевский*, Р.Д. Айдарх анов*
Национальный исследовательский университет «МИЭТ», 124498, Москва, Зеленоград, пл. Шокина, 1; *Факультет биоинженерии и биоинформатики Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, 119234, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, 1/73 Е-mail: master_kom@mail.ru Поступила в p едакцию 10.06.15 г. Посте доpаботки 29.06.15 г.
П pиведены pезультаты исследования отклика cенcоpныx cтpуктуp pезиcтивного типа на остове ДНК-модифицированных углеpодныx нанотpубок в пpиcутcтвии белков тpомбина и альбумина. Пpоведен анализ взаимодействия ДНК-аптамеpов (коpоткиx ДНК-поcледовательноcтей) c углеpодными нанотpубками методами cпектpоcкопии комбинационного pаccеяния c помощью анализа cопpотивления полученный cтpуктуp на pазныx cтадияx cбоpки cенcоpа. Показано, что пpиcоединение аптамеpов к нанотpубке значительно уменьшает G-пик углеpодныx нано-тpубок и вызывает понижение сопротивления cенcоpной cтpуктуpы. Показано, что отклик на экcпониpование белками cущеcтвенно отличаетcя для тpомбина и альбумина, что дает предпосылки к pеализации выcокоcелективного биоcенcоpа. Pезультаты пpоведенныx иccледований могут быть использованы пpи cоздании биологичеcкиx cенcоpов нового поколения, в том числе встраиваемые в пеpcональные cиcтемы монитоpинга отстояния здоpовья.
Ключевые слова: ДНК-аптамер, биосенсор, однослойные углеродные нанотрубки, селективность, спектроскопия комбинационного рассеяния.
И пользование биологичеcкиx cенcо pов (биоcенcоp ов) в анализе и монитор инге отстояния живых объектов являетcя очевидным и наиболее пеpcпективным направлением медицин-cкой диагноcтики. Помимо эксплуатации био-логичеcкиx пpинципов, котоpые обеcпечивает матеpиал чувcтвительного опоя, возникает пер-cпективная возможность персонификации данных сенсор ов или точной настройки на анализируемое вещество путем отбора или «пр ограм-мирования» параметров сенсорного слоя. Данную возможность пр едо ставляют отдельные последовательности ДНК в виде кор отких цепочек нуклеотидов, создаваемые искусственно. Апта-меры являются более предпочтительными материалами, так как могут быть химически синтезированы с выходом до 95% от заданной последовательности нуклеотидов. Специфическая третичная структура аптамера позволяет
Сокращения: ОСНТ - однослойные углеродные нанотрубки, 15-ТВА - 5'-аминомодифицированный тромбиновый аптамер, CDI - 1,1'-карбонилдиимидазол.
селективно связывать конкретный агент (низкомолекулярное вещество, белок и т.д.). При этом одной из критических задач технологии подобных биосенсоров становится создание надежного интерфейса между ДНК и системой обработки информации. В настоящий момент наиболее распространенными являются системы, создаваемые на основе микроэлектронных кремниевых технологий. В частности, углеродные нанотрубки пр едставляют интерес для создания высокочувствительных химических сенсоров [1] для исследования электропроводящих свойств одиночных молекул [2]. Углеродные нанотрубки обладают множеством уникальных свойств, которые позволяют их рассматривать в качестве перспективного матер иала в различных применениях. Нанотрубки можно отнести одновременно как к представителям молекулярного мира, где свойства систем определяются свойствами конкретной молекулы, так и макромира, в котором свойства множества объектов интегрируются в общую функциональную систему. Данное свойство делает нанотрубки уникальным материалом для обеспечения пере-
Рис. 1. Схема сборки биологического сенсора на углеродной нанотрубке.
L ' 1
. ' «V J
Рис. 2. Топография с сетки однослойных углеродных нанотрубок на подложке из полиэтиленнаф-талата.
дачи информации от молекул в современные электронные системы обработки информации. И сследование возможности о рганизации интерфейсов на молекуляр ном уровне в медико-биологических приложениях является актуальным направлением в области применения углеродных нанотрубок.
Принцип работы биологического сенсора на основе углеродных нанотр убок заключается в изменении поверхностного заряда вокруг на-нотрубки, что ведет к изменению ее проводимости [3]. Поверхностный заряд нанотрубки может изменяться за счет специфичных и неспецифичных взаимодействий с биологически-
ми объектами (в частности, белками) [4]. Таким обр азом, задача получения специфического сигнала во многом сводится к специфичности ап-тамера к исследуемым биологическим объектам. П ри этом чувствительный материал должен обладать способностью обменного взаимодействия как с исследуемым биологическим объектом, так и с нанотрубкой.
В данной работе представлены исследования по интеграции углеродных нанотрубок в микроэлектронные процессы для создания сверхтонких проводящих электродов в биологических сенсорах на основе аптамеров.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Формирование биосенсора на углеродных на-нотрубках. Общая схема сборки биосенсора приведена на рис. 1. Сетка углеродных нано-трубок наносится на диэлектрическую подложку (рис. 1, стадии I и II). В качестве гибких подложек использовали пленки полиэтиленнаф-талата (Teijin DuPont Films, Япония) р азмером 10x10 мм и толщиной 125 мкм. В работе использовали чистые однослойные углеродные нанотрубки (ОСНТ) 99,5 масс.%, полученные методом дугового разр яда, которые были пр е-доставлены д.ф.-м.н. А.В. Крестининым (Институт проблем химической физики РАН). Типичная длина нанотрубок, измеренная методом атомно-силовой микроскопии на приборе Со -лвер-П РО (ЗАО «Нанотехнология МДТ», Ро с-сия), со ставляла пор ядка 1000 нм (рис. 2), тем не менее в пучках длина достигает 5 мкм при диаметре пучков ~10 нм. Методика нанесения углеродных нанотрубок на поверхность под-
ложки из раствора описана нами ранее в работе [5] Далее последовательно формируется схема металлизации, обеспечивающая снятие сигналов сенсора (рис. 1, стадия III). Нанотрубка покрывается гидрофобным агентом, обеспечивающим электр остатическую изоляцию проводящего канала нанотрубок от окружающей ср еды (рис. 1, стадия IV), после чего осуществляется посадка специфичного чувствительного слоя. Для демонстр ации р аботы нанотрубок в качестве биологического сенсо ра была пр ове-дена иммобилизация и дополнительная доработка пленки углеродных нанотр убок для обеспечения работы в жидкой среде.
Сборка аптасенсора (биосенсора на основе аптамер а) включает в себя несколько последовательных ковалентных и нековалентных реакций для обеспечения максимальной площади покрытия нанотрубки функциональными группами (стадия V на рис. 1). При этом так как используемые материалы выполняют роль не только электрического изолятора, но и поверхностно-активного вещества, то во время сборки возможен неравновесный процесс, связанный с изменением положения трубок и их количества на поверхности. Для уменьшения влияния нестационарных процессов требуется значительное количество времени. Так, иммобилизация аптамеров на нанотрубках при комнатной температуре длится несколько часов. При этом требуется удалять непрореагировавшие группы, чтобы уменьшить роль неспецифичных взаимодействий.
Нековалентная иммобилизация 5'-аминомо-дифицированного тромбинового аптамера (15-TBA, ООО «Апто-фарм», Россия) на углеродные нанотрубки проводилась с помощью частично гидрофобного агента Tween 20 (неионо-генное поверхностно-активное вещество), гид-роксильные группы которого были активиро-ваны с помощью CDI (1,1'-карбонилдиимида-зол) (в дальнейшем - CDI-Tween). Последующим замещением имидазольной группировки аминогруппой из аминолинкера добивались образования ковалентного коньюгата аптамер-5'-Tween. Подобный подход был описан ранее в работе [6]. Для иммобилизации амино-линкера был использован раствор CDI-Tween в деио-низованной воде с концентрацией 0,05 мг/мл, в который на несколько часов помещали подложки с углеродными нанотрубками.
На следующем этапе проводили нанесение аптамера и удаление непрореагировавших CDI-групп в 0,1 М растворе этаноламина с последующей сушкой. Далее на подложки был нанесен раствор 15-TBA (100 пМ).
1.0
о
а;
0.8
н Ь
о & 0.2
о и
№ стадии
Рис 3. Изменение сопротивления сенсорной структуры на разных стадиях иммобилизации аптамера: 1 - нанесение ОСНТ и напыление контактов, 2 -нанесение CDI-Tween, 3 - нанесение аптамера, 4 -обработка этаноламином.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
На каждой стадии сборки биологического сенсора исследовали сопротивление структуры и регистрировали спектры комбинационного рассеяния света.
Как видно из рис. 3, на всех стадиях со -противление понижается. Падение сопротивления на пер вых двух стадиях может быть связано с увеличением экранирования углеродных нанотрубок CDI-Tween и ДНК. Обработка этаноламином снимает часть ар оматических CDI-групп, увеличивая доступность трубок для растворителя. Тем не менее в случае предлагаемой сенсорной структуры следует рассматривать два механизма рассеяния носителей заряда, вносящих свой вклад в сопротивление структуры: сопротивление тела нанотрубки и контактное сопротивление между нанотрубками. В работе [6] превалирующий вклад вносится телом одной нанотрубки, тогда как область контакта с электродами изолирована от действия раствора. В случае предлагаемой конструкции ОСНТ на полиэтиленнафталатных пленках превалирует контактное сопротивление между самими на-нотрубками.
Для контроля изменений в структуре после каждой стадии создания сенсора проводили исследование методом комбинационного рассеяния света (рис. 4) и на АСМ /рамановском спектрографе CENTAUR U HR (ООО «Нано Скан Технология», Россия).
Наиболее значительный вклад в спектр системы «углеродные нанотрубки-линкер-апта-мер», по-видимому, вносят аптамеры и линкер (рис. 4, спектры 3,4). Наиболее заметное изменение наблюдается в областях пиков 1380, 1480, 1580-1600 и 1642 см-1.
Рис. 4. Спектры комбинационного рассеяния сенсорных структур, снятые после каждой операции сборки сенсора: 1 - подложка с сетк
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.