ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2007, том 54, № 6, с. 841-846
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.1
ТЕНУАЗОНОВАЯ КИСЛОТА, ТОКСИН ВОЗБУДИТЕЛЯ ПИРИКУЛЯРИОЗА, ИНДУЦИРУЕТ БОЛЕЗНЕУСТОЙЧИВОСТЬ И ПРОДУКЦИЮ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА В РАСТЕНИЯХ РИСА
© 2007 г. А. А. Аверьянов*, В. П. Лапикова*, М.-А. Лебран**
*Всероссийский научно-исследовательский институт фитопатологии Российской академии сельскохозяйственных наук, Б. Вяземы, Московская обл.
**FRE2579 CNRS-Байер, Байер Кропсайанс, Лион, Франция Поступила в редакцию 24.01.2007 г.
Исследовано влияние тенуазоновой кислоты (ТК) на фрагменты листьев риса (Oryza sativa L.) и их взаимодействие с совместимыми расами возбудителя пирикуляриоза, гриба Magnaporthe grisea (прежнее название Pyricularia oryzae). TK индуцировала на листьях мелкие бурые некротические пятна. Нанесение ТК (1 или 5 мМ) на листья в смеси со спорами M. grisea индуцировало локальную болезнеустойчивость, проявлявшуюся в уменьшении частоты инфекционных пятен совместимого типа. ТК не была фунгитоксичной, но при контакте с листом усиливала способность диффузатов листа подавлять прорастание спор M. grisea. Фунгитоксичность диффузатов зараженных листьев была больше, чем у здоровых. Антиокислительные ферменты супероксиддисмутаза и каталаза, перехватчики гидроксильного радикала маннит и формиат значительно ослабляли токсичность диффузатов листьев, усиленную под действием ТК. Предполагается, что болезнеустойчивость, индуцированная ТК, по крайней мере, частично опосредована генерацией активных форм кислорода листьями риса, что подавляет развитие гриба прямо или косвенно.
Ключевые слова: Oryza sativa - Magnaporthe grisea - активные формы кислорода - индуцированная устойчивость - некроз - тенуазоновая кислота - фунгитоксичность.
ВВЕДЕНИЕ
Разнообразные физические и химические факторы индуцируют устойчивость растений к инфекционным болезням [1]. Во многих случаях индуцированной болезнеустойчивости в ее механизме участвует окислительный взрыв, а именно, избыточная продукция активных форм кислорода (перекись водорода, супероксидный О- и гид-
роксильный •ОН свободные радикалы) в растительных тканях в ответ на действие индуктора и инфекции. Окислительный взрыв ведет к сверхчувствительному некрозу клеток хозяина, прямому повреждению паразита и другим защитным реакциям [2-5]. Например, при пирикуляриозе риса активные формы кислорода (АФК), диффундирующие из листьев растения-хозяина, подавляют в той или иной степени прорастание спор паразита (Magnaporthe grisea). Эта токсичность
Сокращения: АФК - активные формы кислорода; СОД -супероксиддисмутаза; ТК - тенуазоновая кислота. Адрес для корреспонденции: Аверьянов Андрей Александрович. 143050 Б. Вяземы, Московская обл. Всероссийский научно-исследовательский институт фитопатологии РАСХН. Электронная почта: aaveryanov@post.ru
усиливается у растений восприимчивых сортов риса, если их устойчивость к пирикуляриозу индуцирована высокой температурой [6], некоторыми коммерческими фунгицидами [7] или другими веществами [8]. Устойчивость, индуцированная, по крайней мере, некоторыми микробными элиси-торами, также зависит от АФК [4, 9].
В противоположность элиситорам микробные токсины обычно способствуют совместимости [10]. Однако известны примеры, когда токсины ведут себя, как элиситоры, а именно, индуцируют в растениях некоторые защитные реакции и болезнеустойчивость в целом. В частности, AAL-токсин грибов Alternaria вызывает фрагментацию ДНК в растительных клетках, что сходно с апоптозом [11]. Альфа-пиколиновая кислота, один из токсинов M. grisea, стимулирует подъем продукции Н2О2 и программируемую гибель клеток в листьях и суспензионных культурах риса. Кроме того, опрыскивание листьев риса пиколи-новой кислотой индуцирует их устойчивость к последующему заражению вирулентными спорами M. grisea [12]. Экзогенная пиколиновая кислота (1-3 мМ) подавляет прорастание грибных спор. Эффект частично ослабляется нативной катала-
зой (но не альбумином или кипяченой каталазой), свидетельствуя о способности токсина приводить к образованию АФК [13].
Другой токсин возбудителя пирикуляриоза, тенуазоновая кислота (ТК) [14], также может вести себя, как элиситор. В концентрациях, нетоксичных для гриба, она индуцирует хлороз или образование некротических пятен на листьях риса [15, 16]. Согласно предварительным данным, это свойство ТК может препятствовать успешной колонизации листа грибом [17]. Участие АФК в эффектах ТК не исследовано.
В данной работе мы оценили визуальные симптомы, вызываемые ТК в отдельности или в комбинации с грибным инокулюмом, влияние ТК на способность листа риса выделять фунгитокси-ческие метаболиты и возможное участие АФК в фунгитоксичности диффузатов листьев.
МЕТОДИКА
Растительный материал. Мы использовали растения риса (Oryza sativa L.) восприимчивого сорта Sha-tiao-tsao. Растения выращивали до стадии четырех полностью развернутых листьев (21-23 суток) в климатической камере с ксеноно-вой лампой мощностью 10 кВт при освещенности около 20 клк. Во время темнового и светового периодов (по 12 ч) температура была соответственно 23 и 28°С, а относительная влажность - 95%. Из четвертого листа каждого проростка вырезали фрагменты длиной 6 см (от 6 до 12 см от основания). Десять фрагментов помещали верхней стороной вверх в чашки Петри, на агар с бензими-дазолом [6].
Грибной материал. Природные изоляты Н5-3 (раса 007) и CD-41 возбудителя пирикуляриоза риса, гриба Magnaporthe grisea (Hebert) Barr, культивировали на морковном отваре [18]. Суспензию спор смывали с 10-суточного мицелия и концентрировали фильтрацией в устройстве с плавающим фильтродержателем [19] и мембранным фильтром типа SM с размером пор 8 мкм ("Millipore", США).
Инокуляция растений и оценка симптомов болезни. Растения заражали суспензией спор (105 спор/мл). Две капли суспензии (по 10 мкл) помещали на каждый фрагмент листа. В параллельных вариантах на листья наносили капли раствора ТК (1 или 5 мМ), не содержавшего спор или же смешанного со спорами непосредственно перед инокуляцией. Обработанные листья инкубировали 24 ч в темноте при 23°С, а затем возвращали в климатическую камеру.
Визуальные симптомы, появившиеся после заражения спорами M. grisea или обработки растворами ТК, оценивали через 6-10 дней. Частоту инфекционных пятен совместимого (S, тип 4), промежуточного (MR/MS, тип 3), или несовместимого
(R, тип 1 или 2) типов, а также бессимптомных исходов заражения (R, тип 0) [20] подсчитывали как долю (%) от общего числа капель инокулюма. В каждом варианте анализировали по десять растений. Для каждого типа симптомов подсчитывали средние и стандартные отклонения для 2-4 независимых опытов.
Инокуляция растений и получение диффузатов листьев. Шесть капель по 15 мкл инокулюма помещали с помощью специального держателя [21] на каждый фрагмент листа без его поранения. В варианте со здоровыми листьями на них инкубировали воду вместо споровой суспензии. Одновременно наносили растворы ТК отдельно или в смеси со спорами. После инкубации 24 ч при 23°С капли собирали с одновременным удалением спор инокулюма на бумажном фильтре, помещенном в каплесборник [22]. Полученный препарат называли диффузатом. В каждом варианте опыта использовано по 10 листовых фрагментов.
Определение фунгитоксичности диффузатов.
Этот показатель оценивали по подавлению прорастания спор тест-объекта, относящегося к тому же, что и инокулюм, штамму гриба.
Диффузат листа (80 мкл) смешивали одновременно с 10 мкл споровой суспензии (3.5 х х 104 спор/мл) и 10 мкл воды в лунке 96-луночной полистирольной пластины Titertek для культивирования клеток ("Flow Laboratories", Англия). Помимо диффузатов испытывали влияние растворов ТК (1 или 5 мМ) на прорастание спор. Все упомянутые концентрации - конечные. Чтобы учесть возможные изменения свойств ТК при ее однодневной инкубации сравнивали прорастание спор в растворах ТК свежеприготовленных или же выдержанных в виде капель по 15 мкл на полистироле в тех же условиях, что и капли на листовых фрагментах. Споры проращивали 5 ч в диффуза-тах листьев (или в растворах ТК) при 23°С, а затем фиксировали этанолом. Их прорастание подсчитывали под инвертированным микроскопом Dia-vert ("Leitz Wetzlar", Германия) в пяти повторно-стях по 100 спор в каждом варианте. Все величины (средние ± стандартные отклонения) нормализовали к прорастанию в воде и вычитали из 100%, чтобы оценить ингибирование прорастания.
Чтобы проверить влияние света на токсичность диффузатов (или ТК) для суспендированных в них спор, свежеприготовленные суспензии освещали 75 мин в климатической камере (10 клк, 28°С), а затем переносили в темноту, так что вся инкубация длилась 5 ч. Ранее мы установили, что такое освещение не влияет на прорастание спор в воде.
Оценка участия АФК в фунгитоксичности диф-фузата. Чтобы оценить вклад тех или иных АФК в фунгитоксичность листовых диффузатов, к ним добавляли (вместо 10 мкл воды) одновременно со спорами следующие антиоксиданты [23]: 100 мкг/мл
супероксиддисмутазы (СОД, 2 ед./мкг, бычий эритрокупреин, "Boehringer Mannheim", Германия), 100 мкг/мл каталазы (из печени быка, 11 ед./мкг, "Sigma", США) или перехватчики гидроксильного радикала - 10 мМ маннит ("Serva Feinbiochemica", Германия) или 1 мМ формиат натрия ("Merck", Германия). Инактивированные нагреванием (30 мин на кипящей водяной бане) ферменты СОД или катала-за или бычий сывороточный альбумин ("Sigma") были использованы для контроля. Десферриокса-мин (Desferral, "Ciba Geigi", Швейцария) в концентрации 0.2 мМ добавляли для удаления ионов железа, катализирующих образование •OH из O- и H2O2 [19, 20].
Реактивы. ТК (натриевая соль) была получена химическим синтезом [17]. Ее химическая формула показана на рис. 1.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Симптомы, вызванные ТК, и ее влияние на заражение спорами M. grisea
ТК, помещенная на интактную листовую поверхность, вызывала мелкие бурые некротические пятна через 5-6 дней. Они были сходны с инфекционными пятнами типов 1 и 2 шкалы Latterel [20], и их частота была близкой при обеих концентрациях ТК (табл. 1). Тем не менее, пятна, вызванные меньшей дозой
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.