ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2007, том 54, № 4, с. 517-525
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.1
ТЕПЛОВОЙ ШОК УВЕЛИЧИВАЕТ ТЕРМОРЕЗИСТЕНТНОСТЬ ФОТОСИНТЕТИЧЕСКОГО ТРАНСПОРТА ЭЛЕКТРОНОВ, КОЛИЧЕСТВО МЕМБРАН И ЛИПИДОВ В ХЛОРОПЛАСТАХ ЛИСТЬЕВ ПШЕНИЦЫ
© 2007 г. И. М. Кислюк, Л. С. Буболо, И. Е. Каменцева, Е. Р. Котлова, О. А. Шерстнева
Ботанический институт им. ВЛ. Комарова Российской академии наук, Санкт-Петербург
Поступила в редакцию 05.07.2006 г.
Прогрев 15-16-дневных растений пшеницы (Тпйсит aestivum L.) в течение 3 ч при 37-38°С (тепловой шок, ТШ) увеличивал устойчивость фотосинтетического транспорта электронов, определяемого по восстановлению 2,6-дихлорфенолиндофенола изолированными хлоропластами, к прогреву листьев при 42-48°С на сильном свету (100 клк). Активность реакций ксантофиллового цикла в диапазоне 30-48°С после ТШ не изменилась. За время действия ТШ в зрелых хлоропластах произошло увеличение протяженности тилакоидов, количества гран и среднего количества тилакоидов в гране. Объем тилакоидной системы увеличился в 1.4 раза. Содержание и соотношение хлорофиллов а и Ь, индивидуальных каротиноидов так же, как количество мембранных белков хлоропластов и растворимого белка в листьях остались без изменений. Новообразование фотосинтетических мембран сопровождалось увеличением в 1.5 раза содержания основных хлоропластных липидов. Сделан вывод, что под действием ТШ в зрелых хлоропластах пшеницы сформировались тилакоиды с измененной молекулярной структурой, для которой характерны повышенные отношения липиды/белок и липи-ды/хлорофилл.
ТгШсит aestivum - тепловой шок - терморезистентность - фотоингибирование - транспорт электронов - реакция Хилла - ксантофилловый цикл - полярные липиды - ультраструктура хлоропластов
ВВЕДЕНИЕ
Временное повышение теплоустойчивости клеток (закалка или приобретенная термотолерантность) относится к важным адаптивным реакциям, которые позволяют растению сохранить жизнеспособность при повышении температуры и при некоторых других неблагоприятных изменениях среды. К факторам, повреждающим фо-тосинтезирующие клетки растений и водорослей, в определенных условиях относится видимый свет высокой интенсивности. При торможении метаболизма углерода и уменьшении утилизации поглощенной энергии на ярком свету развивается фотоингибирование - подавление фотосинтети-
Сокращения: ТШ - тепловой шок; ДХФИФ - 2,6-дихлорфе-нолиндофенол; ГЛ - гликолипиды; ДГДГ - дигалактозилди-ацилглицерины; МГДГ - моногалактозилдиацилглицерины; СХДГ - сульфохиновозилдиацилглицерины; ФГ - фосфати-дилглицерины; ФЛ - фосфолипиды; ФХ - фосфатидилхоли-ны; ФЭ - фосфатидилэтаноламины.
Адрес для корреспонденции: Кислюк Ирина Марковна. 197376 Санкт-Петербург, ул. Проф. Попова, 2. Ботанический институт РАН. Электронная почта: imkis@mail.ru
ческой активности, а затем фотоповреждение хлоропластов и фотосинтезирующих клеток.
Предварительный тепловой шок (ТШ) увеличивал устойчивость ФС II ячменя и картофеля к сильному свету при нагреве [1, 2]. По нашим данным [3], ТШ повышал устойчивость фотосинтеза пшеницы к фотоингибированию, индуцированному нагревом. Одновременно в хлоропластах происходило увеличение количества и длины тилакоидов и формирование многотилакоидных гран. Отсутствие изменений в содержании пигментов позволило предположить, что ТШ стимулирует образование фотосинтетических мембран с измененным составом.
Настоящая работа является продолжением исследований функциональных и структурных изменений, которые ТШ вызывает в клетках мезофилла пшеницы. В нашу задачу входило изучение влияния ТШ, во-первых, на термо- и фотостабильность фотосинтетического транспорта электронов от воды через ФС II к искусственному акцептору и на температурную зависимость реакций ксантофиллового цикла; во-вторых, на ультраструктуру хлоропластов и содержание полярных липидов, которые относятся к основным
структурным элементам тилакоидных мембран; в-третьих, на содержание фотосинтетических пигментов, мембранных белков хлоропластов и растворимого белка в листьях.
МЕТОДИКА
Растения озимой пшеницы (Triticum aestivum L.) сорта Мироновская 808 выращивали в сосудах с почвой в климатической камере при температуре 20/15°С (день/ночь), освещенности 10 клк (лампы ДРЛ 250, Россия) и 16-часовом фотопериоде. 15-16-дневные растения в сосудах подвергали 3-часовому ТШ в камере с температурой воздуха 37-38°С и освещенностью около 4 клк.
При определении тепло- и фотоустойчивости фотосинтетического транспорта электронов и температурной зависимости реакций ксантофил-лового цикла пластинки первых и вторых листьев помещали в тонкий слой воды на дно термостатированной камеры с верхней крышкой из толстого плексигласа и выдерживали при разных температурах от 25 до 48°С и разной освещенности от 0 до 100 клк (лампа ДРИЗ-400 с водным фильтром, Россия).
Активность фотосинтетического транспорта электронов через ФС II (реакции Хилла) измеряли в суспензии хлоропластов, подвергнутых осмотическому шоку, по скорости восстановления 2,6-дихлорфенолиндофенола (ДХФИФ, "Sigma", США) в течение 1 мин при насыщающей интенсивности света (15 клк) и комнатной температуре, используя спектрофотометр СФ-26 ("ЛОМО", Россия) при 540 нм.
Для получения суспензии хлоропластов навеску листьев растирали в 50 мМ Трис-HCl (pH 7.6) в отношении 1 : 20 (вес : объем). Гомогенат фильтровали через 2 слоя капрона и центрифугировали 5 мин при 4000 g. Осадок ресуспендировали в стеклянном гомогенизаторе в том же буфере и использовали для определения активности реакции Хилла, затем промывали в 50 мМ Трис-HCl и повторно центрифугировали 5 мин при 4000 g. После экстракции хлорофилла охлажденным (-20°С) ацетоном с добавлением 50 мМ NaCl белки тилакоидных мембран растворяли в 96%-ном этаноле [4], осаждали 20%-ной ТХУ и определяли по методу Matzelt и Homann [5]. Этим методом определяли также количество растворимого белка в листьях.
Содержание хлорофиллов а и b определяли на спектрофотометре Specord М40 ("Carl Zeiss", Германия) в 100%-ном ацетоновом экстракте и рассчитывали по известным формулам [6]. Индивидуальные каротиноиды разделяли методом ТСХ и определяли спектрофотометрически [7].
Общие липиды экстрагировали по методу Bligh и Dyer [8]. Выделение фракций гликолипи-
дов (ГЛ) и фосфолнпндов (ФЛ) проводили с помощью адсорбционной колоночной хроматографии [9]. Индивидуальные компоненты полярных ли-пидов анализировали методом двумерной высоко эффективной ТСХ на пластинах со слоем мик-рофракционированного силикагеля, закрепленного золем кремниевой кислоты. ГЛ разделяли в системе растворителей ацетон : бензол : вода (90 : 30 : 8). Индивидуальные ФЛ анализировали с использованием двумерной высоко эффективной ТСХ по методу Vaskovsky и Terekhova [10] с модификациями в системах растворителей: хлороформ : метанол : толуол : 28%-ный аммиак (65 : : 30 : 10 : 6) - первое направление и хлороформ : : метанол : толуол : ацетон : уксусная кислота : вода (70 : 30 : 10 : 5 : 4 : 1) - второе направление. Липиды идентифицировали, используя стандартные свидетели и специфические реагенты на отдельные функциональные группы [9]. Содержание ФЛ определяли по методу Vaskovsky и др. [11], ГЛ - по методу Radin и др. [12]. При расчетах были приняты следующие молекулярные массы: для моногалактозилдиацилглицеринов (МГДГ) -774.4; дигалактозилдиацилглицеринов (ДГДГ) -936.5; сульфохиновозилдиацилглицеринов (СХ-ДГ) - 837.5; фосфатидилхолинов (ФХ) - 748.1; фосфатидилэтаноламинов (ФЭ) - 744.1; фосфа-тидилглицеринов (ФГ) - 768.4 [13].
Для электронно-микроскопических исследований высечки из средней части листовой пластинки фиксировали 3%-ным глутаровым альдегидом ("Merck", Германия) в 0.1 М фосфатном буфере (pH 7.4) и 2%-ным Os2O4 в том же буфере по общепринятой методике и заливали в смесь арал-дита и эпона. Срезы хлоропластов в клетках двух верхних слоев мезофилла изучали под микроскопом Hitachi H-600 (Япония). Морфометрические измерения проводили на микрофотографиях (х48000) срединных срезов, анализируя по 2030 хлоропластов в каждом варианте. Протяженность мембран измеряли планиметром. Объем хлоропластов и их поверхность определяли по формулам, предложенным Силаевой и Силаевым [14].
На рисунках и в таблицах приведены средние арифметические значения результатов не менее 4 опытов с двумя биологическими повторностями в каждом и их стандартные ошибки. Разницу между средними значениями считали значимой при P < 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Фото- и термостабильность фотосинтетического транспорта электронов через ФС II
Фото- и термостабильность фотосинтетического транспорта электронов определяли по вос-
^
л н о о к я к н м
л «
л
к ^
о н л н о
110 95^ 80 65 50
100
15 клк
100 клк
0 15 30 60 90 120 Продолжительность предварительного освещения, мин
Рис. 1. Последействие экспозиции листьев пшеницы при 25°С и освещенности 15 или 100 клк на активность реакции Хилла.
1,2 - контрольные (незакаленные) растения; 3 - закаленные (3 ч при 38°С) растения. Реакцию Хилла измеряли при комнатной температуре и 15 клк. За 100% приняты значения 365 ± 18 и 354 ± 17 мкмоль ДХФИФДмг хлорофилла ч) у контрольных и закаленных растений соответственно.
ь,
т с о н
я
и т
м
а
80
60
§ 40
20
0
42 44 46 48 Температура прогрева, °С
Рис. 2. Последействие 10-минутного прогрева листьев пшеницы при 100 клк на активность реакции Хилла.
1 - контрольные растения, 2 - закаленные (3 ч при 38°С) растения. Измерение реакции Хилла, как на рис. 1. За 100% приняты значения 361 ± 14 и 346 ± ± 12 мкмоль ДХФИФ/ (мг хлорофилла ч) у контрольных и закаленных растений соответственно.
становлению ДХФИФ в суспензии хлоропластов из листьев, испытавших соответствующее воздействие. Экспонирование листовых пластинок в течение 2 ч во влажной камере при 25°С на слабом свету незначительно влияло на активность реакции Хилла (рис. 1, кривая 1). Увеличение освещенности до 100 клк тормозило скорость восстановления ДХФИФ. Предварительный прогрев растений в течение 3 ч при 37-38°С (ТШ) не влиял на скорость и устойчивость транспорта электронов к фотоингибированию при 25°С (рис. 1, кривые 2 и 3). Повышение температуры
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.