БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 1, с. 5 - 13
УДК 577.15
ТЕРМОДИНАМИКА И ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О РЕГУЛЯЦИИ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ*
Обзор
© 2015 Квиньи Жао
Medical Institute, CRRC, POB 2619, Beijing 100068, PR China; E-mail: qinyizhao@gmail.com
Поступила в редакцию 08.05.14 После доработки 26.08.14
Непременным условием функционирования всех ферментов в клетке является высокоточная регуляция их активности. Имеющиеся представления об аллостерии и вкладе динамики в регуляцию ферментов основаны на экспериментальных моделях и базируются главным образом на эмпирических наблюдениях. В настоящем исследовании мы предложили теоретическую модель термодинамической регуляции ферментативной активности. Главная наша идея состоит в том, что регуляция активности ферментов заключается в регулировании относительного содержания активных конформационных состояний в реакционном буфере. В обзоре рассматриваются и обсуждаются теоретические основы и экспериментальные подтверждения предложенной нами модели. Мы пришли к заключению, что основные принципы регуляции активности ферментов базируются на законах термодинамики и могут быть описаны в рамках представлений о кривой распределения активных конформационных состояний белковых молекул.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: регуляция активности ферментов, термодинамика, активная конформация, кривая распределения.
Регуляция ферментов — это одно из центральных положений в биологии, и в основе современных знаний о ней лежит аллостерический регуляторный механизм. Представления об этом механизме были впервые сформулированы на основе наблюдений за кооперативным связыванием кислорода с гемоглобином [1—3]. Впоследствии все основные достижения в этом вопросе стали именоваться аллостерической регуляцией. Однако в сущности аллостерический механизм продолжает оставаться экспериментальной моделью, и все объяснения, сделанные на его основе, обречены оставаться чисто эмпирическими. Поэтому невозможно избежать споров о выборе между моделями ферментативной регуляции ММС и К^Г [2, 3]. Хорошо обоснован тот факт, что регуляция ферментов связана с динамикой белка (т.е. с изменяемостью молекулы белка и ее термодинамическими свойствами), однако эта взаимосвязь (т.е. термодинами-
Принятые сокращения: REC — комплекс энзим-регулятор, MWC — Монод, Вейман, Шенже, KNF — Кош-ланд, Немети, Филмер.
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM14-126, 28.12.2014.
ческий механизм регуляции) не может быть подвергнута анализу в рамках теории аллосте-рии. Также в рамках эмпирической модели невозможно дать количественное описание этой регуляции. Поэтому для разрешения подобных проблем было необходимо создание теоретической модели.
В последние 10 лет идея динамической регуляции ферментативной активности привлекает большое внимание, поскольку открывает много перспективных направлений и возможностей для исследования [4—10]. Однако отсутствие теоретических основ для согласования белковой динамики с термодинамикой препятствует созданию теоретической модели регуляции ферментативной активности, основанной на термодинамических представлениях.
К счастью, согласование белковой динамики с термодинамикой ранее уже было выполнено [11—14]. Это дает нам возможность построить динамическую модель функционирования фермента и создать модель его аллодинамической регуляции [15, 16]. Эта чисто теоретическая термодинамическая модель может помочь ответить на многие теоретические вопросы, относящиеся к ферментативной регуляции. Главная мысль заключается в том, что на динамику белковой
молекулы влияет множество различных факторов, физических или химических, а изменение динамики молекулы фермента может менять количество возможных активных конформаци-онных состояний, которые молекула белка приобретает в растворе, и тем самым может осуществляться регуляция его каталитической активности. В представленной статье обсуждаются теоретические основы, доказательства и некоторые проблемы, касающиеся предложенной модели.
ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ ТЕОРИИ ДИНАМИЧЕСКОЙ РЕГУЛЯЦИИ АКТИВНОСТИ
Для получения полного представления о термодинамическом механизме регуляции активности ферментов суммируем основные факты и базовые принципы теории.
1) В растворе молекулы любого белка или фермента находятся во многих конформацион-ных состояниях, большинство из которых являются неактивными. Равновесие между ними устанавливается согласно законам термодинамики. В самом простейшем случае существует лишь один активный конформер.
2) Относительное содержание каждого кон-формера меняется в зависимости от различных условий и устанавливается в соответствии с тепловым равновесным состоянием. Содержание каждой отдельной конформационной формы может быть рассчитано из данных по конформа-ционной стабильности белка с использованием функции распределения этих конформацион-ных состояний [14].
3) Термодинамическое состояние одной конформации, такое как энергетический уровень, также варьирует в зависимости от различных условий [14].
4) Изменения в динамике всей белковой молекулы могут в той или иной степени распространяться на ее различные участки в процессе термодинамической реорганизации белка. Это может приводить к конформационным изменениям в отдельных участках молекулы, но не обязательно изменяет конформацию всей молекулы белка.
5) Некоторые внешние факторы, такие как температура, характер растворителя, субстрат, добавление активатора или ингибитора, а также внутренние факторы, например, изменение структуры белка при генетической мутации, оказывают воздействие на конформационную стабильность белковой молекулы и могут контролировать относительное содержание актив-
ных конформаций фермента в состоянии равновесия и их термодинамические характеристики. Соответственно, существуют два возможных механизма воздействия вышеперечисленных факторов на фермент. Во-первых, они могут влиять на термодинамику каждого конформера. Во-вторых, изменение уровней энергии (термодинамического состояния) отдельных конфор-меров приводит к изменению доли активных конформеров и поэтому влияет на каталитическую активность фермента.
6) Влияние разнообразных регуляторов на фермент может термодинамически складываться (интегрироваться) внутри белковой глобулы. (Здесь мы не будем обсуждать этот процесс, поскольку он подчиняется общепринятым принципам регуляции активности ферментов.)
Основное отличие предложенной нами модели от существующих представлений о вкладе динамической составляющей в регуляцию ферментов заключается в том, что наша модель не подразумевает прямого влияния динамических изменений на каталитическую активность; они оказывают свое воздействие на фермент путем изменения относительного содержания молекул белка, находящихся в активных конформациях.
Важным положением теории является представление о кривой распределения (кривая относительного содержания) активных конфор-мационных состояний фермента. Например, о природе воздействующего на фермент регулятора можно судить по разнице между кривой распределения для свободного фермента и кривой для комплекса энзим—регулятор (ЯБС). В этом случае ЯБС можно рассматривать как новый вид белка. По сравнению со свободным ферментом кривая распределения активных форм для ЯБС смещается в другое положение при определенных рабочих условиях. Это явление, названное «конформационным сдвигом» в направлении новых рабочих условий, наблюдалось во многих экспериментах [17—21].
На рис. 1 приведены графики, иллюстрирующие распределение активных конформаций молекул свободного фермента и ЯБС. Можно видеть, что в данном случае регулятор оказывает на фермент положительное воздействие в условиях области а (кривая расположена выше кривой свободного белка) и негативное воздействие в условиях области б (кривая ниже кривой свободного белка); свободный фермент выступает здесь в качестве контроля. Другими словами, регулятор проявляет смешанное действие. Кроме того, эффективность действия регулятора также непостоянна. Это заключение следует также из других многочисленных результатов изучения регуляции белков и ферментов.
Рис. 1. Кривые распределения активных конформаций свободного фермента и комплекса регулятор—энзим (ЯЕС). Р — вероятность активных конформаций фермента, S — количественное выражение рабочих условий (1, концентрация соли, мочевины, значение рН и пр.). По сравнению со свободным ферментом кривая распределения для ЯБС претерпела конформационный сдвиг (в большинстве случаев кривые распределения могут выглядеть несколько иначе)
ОСОБЕННОСТИ УРАВНЕНИЯ АРРЕНИУСА
ДЛЯ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ РЕАКЦИИ
Температура является универсальным фундаментальным фактором, влияющим на активность ферментов любого типа, и всякая презен-тируемая модель регуляции ферментов должна содержать кинетическое описание поведения фермента в зависимости от температуры.
Экспериментальные исследования позволяют установить многие характерные особенности ферментативной кинетики. С другой стороны, экспериментальные данные могут быть использованы для оценки профиля кривой распределения активных конформаций и других особенностей ферментативной кинетики (обсуждается ниже).
Стандартное уравнение Аррениуса, описывающее кинетику простых химических реакций, выглядит следующим образом:
к = Ае-ЛЕ/квТ,
где к — константа скорости химической реакции, кв — универсальная газовая постоянная (постоянная Больцмана), А — преэкспоненци-альный коэффициент, ЛЕ — энергия активации химической реакции, Т — абсолютная температура (К).
В соответствии с динамической моделью для ферментативных реакций и с функцией распределения конформационных состояний белка уравнение Аррениуса для этих реакций выглядит следующим образом [14]:
к = АРе-[ЛЕ0+вт(Т-Т0)1квТ = APDтe-ЛEo/kвT, (1)
где Р — вероятность существования данной активной конформации фермента, Т0 — референс-ная температура, А — преэкспоненциальный коэффициент при температуре Т0, ЛЕ0 — энергия активации ферментативной реакции при температуре Т0, Dт — коэффициент, выведенный при анализе термодинамики переходного состояния ферментативной реакции
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.