ОНТОГЕНЕЗ, 2009, том 40, № 4, с. 307-320
УДК 591
тезисы докладов конференции молодых ученых института биологии развития им. н.к. кольцова ран (17-18 декабря 2008 г.)
исследование экспрессии генов транскрипционных факторов и сигнальных молекул при регенерации
сетчатки тритона
© 2009 г. П. П. Авдонин, Ю. В. Маркитантова, Э. Н. Григорян, Р. Д. Зиновьева
Лаборатория проблем регенерации
Работа посвящена изучению молекулярно-ге-нетических механизмов регенерации сетчатки у взрослого тритона Pleurodeles waltl, происходящей в результате трансдифференцировки клеток пигментного эпителия. Эффективный подход к пониманию механизмов регенерации - сравнительный анализ экспрессии генов, инициирующих и контролирующих последовательные стадии развития сетчатки позвоночных и регенерации сетчатки у тритонов. В основе развития сетчатки позвоночных лежит эволюционно-кон-сервативная сеть генов глазного поля: Pax6, Six3, Rx, ^, Otx2, Mitf, Pitx2, FGF2, TGFp2, Shh, Wnt, Bmp4. Задача наших исследований состоит в идентификации генов, которые могут запускать и контролировать процесс регенерации сетчатки. Проводя параллель между развитием и регенерацией тканей глаза, в частности сетчатки, мы предполагаем существование сходных механизмов контроля обоих процессов.
В ходе наших исследований в тканях глаза тритона идентифицирован ряд генов, кодирующих гомеобокссодержащие транскрипционные факторы Рахб, 01x2, 81x3, РИх2 и сигнальные молекулы РвР2, Тврр2. Методом ПЦР выявлено возрастание уровня экспрессии регуляторных генов Pax6, Six3, FGF2 в раннем зачатке регенерирующей сетчатки на стадии формирования нейробла-стов - клеточных источников всех типов клеток сетчатки. Активация исследуемых регуляторных генов на фоне снижения экспрессии регуляторно-го гена Otx2 и ингибирования гена меланогенеза RPE65 в зачатке регенерирующей сетчатки свидетельствует об индукции трансдифференцировки клеток пигментного эпителия. С помощью метода иммунохимии локализованы белки РвР2,
Тврр2 в цитоплазме, а Pax6, Pitx2 - в ядрах ней-робластов регенерирующей сетчатки. В депиг-ментирующихся клетках пигментного эпителия на стадии образования нейробластов иммунопо-зитивные сигналы для исследуемых белков не выявлены. Обнаружен сходный паттерн экспрессии транскрипционных факторов Рахб и РИх2 и сигнальных белков РвР2, Тврр2 в нейробластах сетчатки на ранней стадии регенерации, а также в клетках внутреннего ядерного слоя и ганглиозных клетках на поздних стадиях регенерации сетчатки. Паттерн экспрессии исследуемых генов в регенерате сетчатки на поздней стадии имеет много общего с наблюдаемым в нативной сетчатке. Однако в на-тивной сетчатке обнаружены региональные отличия в локализации исследуемых транскрипционных факторов. РИх2 выявляется во всех ядерных слоях сетчатки, а Рахб - в клетках внутреннего ядерного слоя и в ганглиозных клетках.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что при регенерации сетчатки тритона происходит активация изучаемых нами транскрипционных факторов и сигнальных молекул, координированная работа которых инициирует и контролирует нормальное развитие сетчатки. Наши данные, сопоставленные с имеющимися в литературе, свидетельствуют о том, что регуляторные гены Pax6, Otx2, Six3, FGF2, TGFв2, Pitx2 участвуют в формировании сети взаимодействий, которая не только контролирует трансдифференци-ровку клеток пигментного эпителия - ключевую стадию регенерации сетчатки, но также и последовательные стадии ее восстановления.
Работа поддержана РФФИ (проект № 08-0400462).
307
5*
особенности развития опухоли walker 256 после трансплантации крысам brattleboro
© 2009 г. М. А. Афанасьева
Лаборатория гистогенеза
Крысы Brattleboro характеризуются отсутствием синтеза и секреции вазопрессина в гипоталамусе и являются ценной моделью для изучения взаимодействия нейроэндокринной и иммунной систем. Ранее мы обнаружили устойчивое снижение темпов роста линейно-неспецифической кар-циносаркомы Walker 256 у крыс Brattleboro по сравнению с физиологически нормальными крысами WAG. При повторном введении клеток Walker 256 крысам Brattleboro опухоль не возникала, что свидетельствует о непосредственном участии иммунной системы в обнаруженном феномене. Специфический иммунный ответ невозможен без эффективного представления опухолевых антигенов. Так как одними из ключевых участников этого процесса являются протеасо-мы, мы с помощью метода Вестерн-блоттинга исследовали динамику содержания тотального пула протеасом, иммунных протеасом, 19S-субчасти-цы 26S-протеасом и активатора протеасом белка РА28 в клетках опухоли Walker 256 после ее трансплантации крысам Brattleboro и WAG.
В опухоли, привитой крысам Brattleboro, в отличие от таковой у крыс WAG общее содержание протеасом постепенно уменьшалось: на 27 и 23% в период с 7-х по 14-е и с 14-х по 24-е сут после прививки соответственно. Белок Rpt6, маркер 19S-субчасти-
цы, которая является частью 26S-протеасомы и осуществляет распознавание и подготовку убик-витинированных белков к гидролизу, практически не выявлялся в опухоли у крыс Brattleboro начиная с 14-х сут. В опухоли у крыс Brattleboro к 7-м сут после прививки уровень иммунной субъединицы LMP7 был снижен почти вдвое по сравнению с опухолью у крыс WAG. Однако к 14-м сут он возрастал в два раза. Подобная динамика наблюдалась и в отношении иммунных субъединиц LMP10 и LMP2. В опухоли у крыс WAG динамика была обратной: наблюдалось снижение (на 45%) в период с 7-х по 14-е сут и возрастание (на 50%) с 14-х по 24-е сут. В отношении активатора РА28 отличия между линиями животных были слабо выражены.
По-видимому, в клетках опухоли Walker 256 у крыс Brattleboro иммунные 20S-протеасомы в комплексе с активатором РА28 или без него образуют антигенные эпитопы и способствуют обнаружению и уничтожению этих клеток иммунной системой.
Увеличение уровня конститутивных 26S-про-теасом наряду с уменьшением содержания иммунных протеасом в опухоли у крыс WAG к 14-м сут обеспечивают ее активный рост и уход из-под иммунного надзора.
особенности эмбриогенеза мутантов leg-arista-wing complex с нарушенной экспрессией фактора транскрипции trf2
у Drosophila melanogaster
© 2009 г. Н. В. Бурдина
Лаборатория генетических основ морфогенеза
Геи leg-arista-wing complex/TBP related factor 2 тральной борозды. Этот процесс, очевидно, наи-
(lawc/trf2), кодирующий фактор базовой тран- более чувствителен к колебаниям уровня экс-
скрипции дрозофилы, продуцирует две изоф°р- прессии гена lawc/trf2, более сильные аллели до-мы белка - полноразмерную и укороченную. Мы
исследовали зиготическую и материнскую функции гена, используя изолированные гипоморф-ные летальные аллели с нарушенной экспрессией каждого из его продуктов.
Фенотип погибших эмбрионов показал, что небольшое нарушение концентрации любой из изоформ белка LAWC/TRF2 в слабых аллелях приводит к неправильному формированию вен-
полнительно вызывают нарушения сокращения зародышевой полоски и спинного закрытия. Эти процессы связаны с морфогенетическим движением и зеркально отражают ранозаживление у позвоночных, при котором обнаженная мезодер-мальная ткань покрывается эпителиальными клетками. Экспрессия полноразмерной изофор-мы специфически контролирует нейрогенез, воз-
можно, через активацию сигнального пути Notch, так как погибшие эмбрионы из линий со сниженной экспрессией этой изоформы проявляют ней-рогенный фенотип, а исследование их нервной системы выявляет ее гипертрофию, характерную для мутантов гена Notch. Мы показали, что особой функцией в эмбриогенезе обладает эволюци-онно вариабельный N-концевой отдел полноразмерной изоформы белка LAWC/TRF2. Его экспрессия необходима для миграции и слияния трахейных ветвей при формировании дыхательной системы зародыша. Исследуя материнскую функцию lawc/trf2, мы обнаружили, что ее недостаток приводит к асинхронным делениям ядер эмбрионального синцития, в результате чего у
эмбрионов происходит дезорганизация полярных структур.
Таким образом, несмотря на то что продуктом lawc/trf2 является один из трех известных на данный момент у дрозофилы факторов базовой транскрипции, нарушение его зиготической и материнской экспрессии вызывает хотя и сильные, но весьма специфические дефекты. Главным образом они связаны с нарушением либо синхронных делений дробления, либо миграции и движения эпителиальных клеток, в основе которых лежат скоординированные изменения их формы и размера.
анализ экспрессии ряда регуляторных и тканеспецифических генов в клетках сетчатки и переднего мозга человека в развитии и в культуре ткани
© 2009 г. Б. И. Вердиев
Лаборатория экспериментальной нейробиологии
Процессы развития неокортекса и сетчатки глаза во многом сходны. Обе структуры формируются из нейроэпителия переднего мозгового пузыря. Неокортекс и сетчатка являются ламинарными структурами, в которых в ходе морфогенеза используется сходный механизм гетерохронии и радиальной миграции нейробластов по отросткам клеток радиальной глии. Механизмы, лежащие в основе этих процессов, и факторы, регулирующие их, мало изучены, поэтому целью работы был сравнительный анализ экспрессии ряда регуляторных и тканеспецифических генов в ходе нормального развития и в культуре клеток неокортекса мозга и сетчатки с помощью методов ПЦР и иммуногистохимии.
Ранее методом ПЦР было показано, что в начале нейрогенеза (9 нед развития, нр) кора мозга и сетчатка эмбриона человека сходны по паттерну экспрессии исследованных регуляторных факторов Pax6, 0ct4 и NAN0G. В конце нейрогенеза (20 нр) в переднем мозгу уже не выявляются регуляторные гены плюрипотентного статуса, а в сетчатке сохраняется прежний паттерн. Для уточнения полученных результатов применили метод количественной ПЦР как более чувствительный по сравнению с ПЦР. кДНК-библиотеки синтезировали на обработанной ДНКазой тотальной РНК с использованием
олиго-дТ-праймера. Контроль отсутствия геномной ДНК проводили до и после обработки ДНКазой, а также после реакции обратной транскрипции.
Поскольку проблемой в исследовании эмбрионального материала является его гетерогенность, нужно было подобрать оптимальный эндог
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.