ш
УДК 577.112.(083+088)
ТИРАМИН И ТРИПТАМИН КАК ЛИГАНДЫ АФФИННЫХ СОРБЕНТОВ МЕДИЦИНСКОГО И БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ
© 2015 г. П. А. Левашов*- **, #, Е. Д. Овчинникова*, М. И. Афанасьева*, Д. А. Фрид*, А. А. Азьмуко*, И. Ю. Адамова*, С. Н. Покровский*
*ФГУ "Российский кардиологический научно-производственный комплекс"Министерства здравоохранения
и социального развития Российской Федерации, 121552 Москва, ул. 3-я Черепковская, д. 15а **Химический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва, ГСП-1, Ленинские горы, д. 1, стр. 3 Поступила в редакцию 21.07.2014 г. Принята к печати 04.08.2014 г.
Предложена новая методика получения аффинных сорбентов на основе лигандов — тирамина и триптамина. Для полученных хроматографических материалов были исследованы сорбционные характеристики. Показано, что триптамин-сефароза и тирамин-сефароза эффективно связывают IgG, IgA, липопротеид (а) (Lp(a)) и липопротеиды низкой плотности (LDL) из плазмы крови. Сорб-ционная емкость (мг/мл геля) составила IgG — 4—9, IgA — 2—4, Lp(a) — 3—5 и LDL — 5—7. Обнаружено, что Lp(a) и IgG могут связываться с сорбентом как независимо, так и в виде комплекса Lp(a) с IgG, существование которого может говорить о наличии у некоторых пациентов аутоантител к Lp(a). Новые сорбенты просты в синтезе, стабильны при использовании и хранении, могут применяться в медицинских и биотехнологических целях для связывания Lp(a), LDL, IgG, IgA.
Ключевые слова: сорбенты аффинные, тирамин и триптамин как лиганды, иммуноглобулины, IgG, липопротеиды, Lp(a), LDL, аутоантитела.
Б01: 10.7868/8013234231501011Х
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время сорбенты, связывающие такие основные компоненты плазмы крови, как липопротеиды и иммуноглобулины, активно используются в медицинских технологиях в процедурах удаления патогенных компонентов из крови пациента. Подобные сорбенты также применяются в препаративной биохимии для выделения биополимеров и их комплексов. В большинстве применяемых на сегодняшний день сорбентов, специфичных к липопротеидам и иммуноглобулинам, в качестве лигандов используются антитела и бактериальные белки [1—6], что обусловливает высокую стоимость хроматографических материалов и ограничивает возможности по стерилизации. В последние годы идет активный поиск простых лигандов-миметиков, способных заменить лиганды-белки [7—11].
В литературе описано несколько примеров создания сорбентов с триптамином [11—13] и тира-мином в качестве лигандов [13—15]. Данные гидро-
Сокращения: Ьр(а)-липопротеид а; HDL, LDL и VLDL — липопротеиды высокой, низкой и очень низкой плотности; HSA — человеческий сывороточный альбумин. # Автор для связи (тел. +7 (926) 303-50-14; факс: +7 (495) 939-54-17; эл. почта: levashov@yahoo.com).
фобные лиганды потенциально могут взаимодействовать с разнообразными мишенями-белками, при этом просты по структуре и весьма удобны для синтеза сорбентов. Эти лиганды и их производные присутствуют в организме человека и входят в состав ряда лекарственных средств, поэтому безопасны при медицинском использовании. Однако информация о возможностях связывания компонентов плазмы крови человека такими хроматографическими материалами весьма ограничена.
Целями работы стало: во-первых, создание простой удобной методики, обеспечивающей получение стабильных в работе и эффективных в связывании биополимеров сорбентов на основе триптамина и тирамина; во-вторых, исследование способности связывания новыми сорбентами липопротеидов и иммуноглобулинов плазмы крови с точки зрения их практического применения в медицине и биотехнологии. При разработке методик синтеза учтен опыт наших предыдущих работ по созданию высокоэффективных сорбентов медицинского и биотехнологического назначения, стабильных при хранении и использовании [16, 17].
Рис. 1. Схематичное изображение молекулярной конструкции соединения лиганда и матрицы: тирамин-сефароза (1), триптамин-сефароза (2).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В ходе работы была предложена схема получения сорбента путем присоединения лиганда к ами-нированной матрице конденсацией с глутаровым альдегидом и последующего восстановления основания Шиффа. В составе сорбента пространственные структуры триптамина и тирамина сохранены, включая аминогруппу, которая из первичной стала вторичной (рис. 1). В предложенной конструкции лиганд соединен с матрицей гибким молекулярным спейсером, содержащим в своем составе дополнительные вторичные аминогруппы. Полученные в работе сорбенты содержали 35 ± 3 мкмоль трипта-мина и 32 ± 4 мкмоль тирамина на 1 мл геля осевшей сефарозы, соответственно.
Было исследовано связывание новыми сорбентами иммуноглобулинов и липопротеидов различных классов (табл. 1). Как видим, оба хро-матографических материала хорошо удаляют IgG, IgA, а также атерогенные липопротеиды Lp(a) и LDL. Синтезированные нами сорбенты также частично удерживали неатерогенные липо-протеиды высокой плотности (HDL). Частичная сорбция HDL не является положительной характеристикой с точки зрения медицинского применения, однако может быть интересна для препаративной биохимии при разделении липопроте-идов различных классов. Связывания сорбентами IgM и IgE не было обнаружено в пределах погрешности эксперимента. Из сравнения количеств сорбированных Lp(a) и остальных связанных компонентов можно сделать вывод о том, что
Таблица 1. Связывание общего белка, 1бО, 1§Л, Ьр(а), общего холестерина (ТСЬ), холестерина липопротеидов (ЬБЬ-СЬ и ЫБЬ-СЬ)
Сорбент Сорбционная емкость, мг/мл геля
общий белок IgG IgA Lp(a) TCh LDL-Ch HDL-Ch
Тирамин-сефароза 35.2 ± 2.2 9.2 ± 1.1 4.4 ± 1.3 3.4 ± 0.3 6.5 ± 0.6 5.1 ± 0.6 0.8 ± 0.3
Триптамин-сефароза 32.4 ± 2.5 3.9 ± 0.8 2.3 ± 0.9 4.6 ± 0.4 8.8 ± 0.7 7.1 ± 0.9 1.1 ± 0.3
Иммуносорбент с поликлональными антителами к IgG 14.5 ± 1.7 13.5 ± 0.9 0 0 0 0 0
Иммуносорбент с поликлональными антителами к Lp(a) 4.5 ± 1.7 0 0 5.3 ± 0.4 2.5 ± 0.3 0 0
Иммуносорбент с поликлональными антителами к LDL 5.1 ± 2.1 0 0 0 4.9 ± 0.5 4.9 ± 0.5 0
* Образцы плазмы крови представляли собой смесь плазм 5 разных пациентов с конечными характеристиками 67.4 ± 1.2 мг/мл общего белка, 11.2 ± 0.6 мг/мл ^О, 2.3 ± 0.5 мг/мл 1&Л, 1.5 ± 0.4 мг/мл ^М, 190 ± 1.4 МЕ/мл ^Е, 0.8 ± 0.11 мг/мл Ьр(а), 1.7 ± ± 0.15 мг/мл ЬБЬ-СИ и 0.5 ± 0.14 мг/мл ЫБЬ-ОИ.
Рис. 2. Изотермы адсорбции человека на тира-мин-сефарозе (1), триптамин-сефарозе (2), иммуно-сорбенте с поликлональными антителами к (3).
триптамин-сефароза в сравнении с тирамин-се-фарозой демонстрирует большую сорбционную емкость и большую специфичность по отношению к связыванию Ьр(а). Количество общего удаленного белка превышает величину, которая определялась бы связыванием только иммуноглобулинов и липопротеидов. Вероятно, данные сорбенты извлекают из плазмы крови также ряд других белков, однако вопрос их идентификации выходит за рамки исследования данной работы.
Для определения индивидуальных констант связывания исследуемых компонентов плазмы крови мы провели эксперименты с применением препаратов очищенных биомолекул. На рис. 2 приведены изотермы адсорбции 1§С триптамин-сефарозой и тирамин-сефарозой в сравнении с данными по иммуносорбенту с иммобилизованными моноспецифическими поликлональными антителами. Полученные изотермы удовлетворительно описываются уравнением Ленгмюра, поэто-
Свободный Ьр(а) в растворе, мкг/мл
Рис. 3. Изотермы адсорбции Ьр(а) на триптамин-се-фарозе (1), тирамин-сефарозе (2), иммуносорбенте с поликлональными антителами к Ьр(а) (3).
му можно определить константы десорбции и максимальные сорбционные емкости. Рассчитанные сорбционные характеристики представлены в сводной табл. 2. Максимальная сорбционная емкость по 1§С у триптамин-сефарозы и тирамин-сефарозы превосходит таковую для иммуносорбента в эксперименте с очищенным 1§0, что может объясняться большим числом участков связывания на поверхности хроматографического материала. Величина константы десорбции 1§С для тирамин-се-фарозы существенно меньше, чем для триптамин-сефарозы, что делает ее более предпочтительной при использовании в качестве аффинного сорбента для выделения и очистки 1§С.
Из изотерм связывания Ьр(а) триптамин-сефа-розой, тирамин-сефарозой и иммуносорбентом с поликлональными антителами к Ьр(а) (рис. 3), принимая величину средней молекулярной массы частицы Ьр(а) 2800 кДа [18], можно оценить численное значение константы десорбции данного
Таблица 2. Сводные характеристики связывания для очищенных препаратов
Сорбент Максимальная сорбционная емкость, мг/мл геля Константа десорбции, М
Ьр(а) ША Ьр(а) ША
Тирамин-сефароза 23.8 ± 1.7 2.0 ± 0.3 21.4 ± 3.3 6.8 ± 0.7 х 10-6 3.4 ± 0.4 х 10-10 1.3 ± 0.3 х 10-4
Триптамин-сефароза 25.0 ± 1.8 2.2 ± 0.4 23.3 ± 3.7 2.9 ± 0.4 х 10-5 2.8 ± 0.4 х 10-10 1.1 ± 0.3 х 10-4
Иммуносорбент с поликлональными антителами к 16.1 ± 1.1 0 0 7.5 ± 0.9 х 10-7 0 0
Иммуносорбент с по-ликлональными антителами к Ьр(а) 0 1.9 ± 0.3 0 0 5.1 ± 0.9 х 10-9 0
биомолекулярного комплекса (табл. 2). Константы десорбции Lp(a) для тирамин-сефарозы и трипта-мин-сефарозы неожиданно оказались даже ниже, чем для иммуносорбента, что свидетельствует о прочном связывании Lp(a) с триптамин-сефарозой и тирамин-сефарозой. Тем не менее, в эксперименте сорбции Lp(a) из плазмы (табл. 1) иммуносорбент с поликлональными антителами несколько выигрывает по сорбционным параметрам, что вероятно связано с большей селективностью сорбента, но вовсе не с прочностью связывания.
Столь низкие константы десорбции Lp(a) для триптамин-сефарозы и тирамин-сефарозы гипотетически могут быть обусловлены тем, что структуры, образованные иммобилизованными лигандами, обладают некоторой схожестью с молекулярным мотивами ряда внеклеточных участков белков семейства рецепторов липопротеидов. За связывание Lp(a) в организме отвечают в первую очередь рецептор VLDL (липопротеидов очень низкой плотности) и рецептор мегалин [19—26]. Лиганды на основе триптамина и тира-мина могут имитировать элементы поверхности тех участков природного пептида, где есть много остатков Trp и Tyr, экспонирующих боковые радикалы во внешнюю среду. Аминогруппы, которые пр
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.