ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2007, том 54, № 6, с. 864-869
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ^^^^^^^^^^^^ СТАТЬИ
УДК 581.1:57.084.1:578.74:57.042.5
ТКАНЕСПЕЦИФИЧЕСКАЯ ЭКСПРЕССИЯ ПОВЕРХНОСТНОГО АНТИГЕНА ВИРУСА ГЕПАТИТА В В КЛЕТКАХ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ И КУЛЬТУРЫ ТКАНЕЙ
© 2007 г. Е. Б. Рукавцова*, Т. В. Абрамихина*, Н. Я. Шульга**, В. А. Быков**, Я. И. Бурьянов*
*Филиал института биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской
академии наук, Пущино, Московская обл. **Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений, Москва
Поступила в редакцию 07.02.2007 г.
Получены растения табака (^1сойапа (аЬасит L.) с геном HBsAg под контролем гибридного промотора (Aocs)зAmasPmas с регуляторными элементами агробактериальных генов октопинсинтазы и маннопинсинтазы и этого же промотора с интроном гена алкогольдегидрогеназы кукурузы аёН1. Присутствие интрона гена аёН1 не приводило к существенному изменению экспрессии гена НВsАg в растениях. Проведено сравнение уровня синтеза поверхностного антигена вируса гепатита В (HBs-антигена) в трансгенных растениях, экспрессирующих ген НВsАg под контролем различных промоторов. Количество HBs-антигена в растениях с геном HВsAg под контролем агробактериальных гибридных промоторов (Aocs)3AmasPmas было максимальным в корнях растений и достигало 0.01% от общего количества растворимого белка. Количество HBs-антигена в растениях с геном НВsАg под контролем двойного промотора 35 S РНК вируса мозаики цветной капусты оставалось одинаковым во всех органах растений и достигало 0.06% от общего количества растворимого белка. На основе растений с геном НВsАg получены культуры каллусов и "косматых корней", синтезирующие HBs-антиген.
Ключевые слова: Мсо^апа /аЬасыт - трансформация - промоторы - HBsAg.
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время разрабатываются технологии производства субъединичных вакцин нового поколения на основе трансгенных растений, которые могут стать альтернативой для получения дешевых и безопасных препаратов по сравнению с их традиционными продуцентами. Растительные клетки имеют энзиматические системы посттрансляционной модификации, необходимые для сборки синтезируемых мономерных белков вакцины в иммуно-генные мультимерные формы. В растениях можно осуществить полноценный синтез целевых антигенов, способных вызывать активный иммунный ответ [1]. Показано, что синтезируемые в растениях вирусные и бактериальные антигены стимулировали у животных образование иммуноглобулинов против соответствующих патогенов [2-7]. В настоящее время в мире создаются и исследуются транс-
Сокращения: ПЦР - полимеразная цепная реакция; HВsAg, HВs-антиген - поверхностный антиген вируса гепатита В; CaMV 3588 - двойной промотор 358 РНК вируса мозаики цветной капусты; Km - канамицин. Адрес для корреспонденции: Рукавцова Елена Борисовна. 142290 Пущино, Филиал института биоорганической химии РАН. Факс: 007 (4967) 33-05-27; электронная почта: ruk@ АЬкЬ. serpukhov.su
генные растения в качестве продуцентов вакцин против различных возбудителей болезней человека, в том числе и вакцины против вируса гепатита В [3, 8, 9]. Однако коммерческие вакцинные препараты на основе трансгенных растений до сих пор не созданы.
Ранее мы получили растения табака, экспресси-рующие синтетический ген поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) под контролем одинарного и двойного промоторов 358 РНК вируса мозаики цветной капусты (СаМУ 358 и СаМУ 3588 соответственно) [10, 11]. Использование двойного промотора 358 увеличило синтез антигена до 0.05% от суммарного количества растворимого белка. Получены также трансгенные растения картофеля, экспрессирующие ген HBsAg под контролем этого же промотора и промотора гена пататина клубней картофеля. Содержание HBs-антигена в клубнях картофеля достигало более 1 мкг/г массы клубня и было максимальным в растениях, экспрессирующих ген НВsАg под контролем двойного промотора -СаМУ 3588.
Для получения растений-продуцентов вакцины против гепатита В с тканеспецифической экспрессией этого гена в целых растениях и культуре
тканей, может быть перспективным использование тканеспецифических промоторов, в частности агробактериальных гибридных промоторов (Aocs)3AmasPmas. Эти промоторы состоят из ре-гуляторных элементов генов октопинсинтазы (ocs) и маннопинсинтазы (mas), выделенных из Agrobacterium tumefaciens. Ранее было показано, что эти промоторы обеспечивали в растениях экспрессию гена ß-глюкуронидазы (GUS) во много раз большую, чем под контролем двойного промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты [12].
Цель настоящей работы - получение трансгенных растений табака, синтезирующих поверхностный антиген вируса гепатита В под контролем промоторов (Aocs)3AmasPmas с регуляторными элементами агробактериальных генов октопинсинтазы и маннопинсинтазы и анализ экспрессии гена HBsAg в различных клетках целых растений и культуры каллусов и "косматых корней" (hairy roots).
МЕТОДИКА
Конструирование плазмид для трансформации растений. В качестве источника гена использовали рекомбинантную плазмиду pSS-HBsAg, содержавшую синтетический ген, кодирующий полипептид HBsAg/mayw [13]. В экспериментах по клонированию использовали два вектора для трансформации растений - pE1802 и pE1945, которые содержат промотор (Aocs)3AmasPmas, любезно предоставленные докт. Gelvin (Университет Пердью, США) [12]. Фланкирование гена HBsAg специфическими последовательностями для молекулярного клонирования осуществляли с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием двух праймеров, содержащих сайты рестрикции KpnI и SaH: 5'-CGGGTACCATGGAAAACATTACTT и 5'-CGGTCGACCTATCATTAAATGTAAAC. Реакционная смесь содержала 0.1 мкг плазмидной ДНК pDES20 в качестве матрицы, 25 мМ KCl, 60 мМ Трис-HCl, pH 8.5 (при 25°С), 1.5 мМ MgCl2, 0.1%-ный Тритон X-100, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 0.2 мМ смеси дезоксинуклеотидтрифосфатов ("USB", США), по 0.25 мкМ каждого праймера и 2.5 ед. ДНК-полимеразы Taq ("СибЭнзим", Россия).
Реакцию проводили в объеме 50 мкл при следующих условиях: 94°C - 5 мин; 30 циклов: 94°C -1 мин, 55°C - 1 мин, 72°C - 1 мин, затем 72°C -7 мин на амплификаторе Gene Amp® PCR System 2400 ("Perkin-Elmer", США). Амплифицированный ген клонировали в бинарный вектор pE1802 для трансформации растений по сайтам рестрикции KpnI и SalI. Для клонирования в вектор pE1945 ген HBsAg был вырезан из плазмиды pSS-HBsAg по сайтам рестрикции XhoI и Cf9I и встроен в вектор по этим же сайтам. Полученными конструкциями трансформировали штамм Escherichia coli HB101. Полученные конструкции, содержавшие ген HBsAg
в прямой ориентации относительно промотора, переносили в штамм A. tumefaciens LBA4404 (pAL4404) [14] методом прямой трансформации [15]. Анализ ДНК полученных клонов проводили методом гибридизации по Саузерну с меченным 32P ПЦР-про-дуктом гена HBsAg [16].
Трансформация растений. Растения табака (Nicotiana tabacum L.) сорта Самсун выращивали in vitro в 0.5-1.0-литровых культуральных сосудах на агаризованной среде мС [17] без фитогормо-нов при 24-26°С, при освещенности 2 клк и относительной влажности воздуха 65%. Культурой полученных агробактериальных штаммов заражали листовые диски по стандартной методике [18]. Для этого листовые диски кокультивировали в течение двух суток с ночной культурой агробактерий, а затем переносили их на селективную среду МС с гормональными добавками (1 мг/л БАП, 0.1 мг/л НУК), сульфатом канамицина (Km, 50 мг/л) и цефо-таксимом (500 мг/л). Регенерированные побеги пассировали на селективной среде МС. Каллусы получали из листовых эксплантов трансформированных растений на среде МС, содержавшей 3% сахарозы, 0.5 мг/л БАП, 2 мг/л НУК, 50 мг/л Km. Культуру "косматых корней" получали на безгормональной среде МС, заражая листовые диски трансгенных растений штаммом A. rhizogenes A4 [19].
Выделение ДНК из листьев табака проводили по методу [20]. Листья растирали в пробирках Eppendorf объемом 1.5 мл, добавляли 0.4 мл буфера для экстракции (0.2 М Трис-На, pH 7.5, 0.25 М NaCl, 25 мМ ЭДТА, 0.5% ДДС), перемешивали и инкубировали 1 ч при комнатной температуре. Экстракты осветляли центрифугированием при 12 000 об./мин, ДНК осаждали равным объемом изопропанола и осадок растворяли в 100 мкл буфера ТЕ (10 мМ Трис-На, 1 мМ ЭДТА, рН 8.0). Полученную растительную ДНК использовали в качестве матрицы в ПЦР.
ПЦР-анализ гена HBsAg проводили в реакционной смеси, содержавшей 0.5-1.0 мкг геномной растительной ДНК. ПЦР проводили в условиях, описанных выше.
Иммуноферментный анализ количественного содержания поверхностного антигена вируса гепатита В в трансгенных растениях проводили по описанной нами методике [12] с незначительными модификациями. Листья, корни и каллусы анализированных растений растирали в жидком азоте и добавляли буфер для экстракции (0.05 М Na-фосфатный буфер, рН 7.5, 0.15 М NaCl, 0.001 M ЭДТА, 0.3%-ный Твин 20, 0.0004 М фенилметил-сульфонилфторид, 0.5%-ный аскорбат натрия). Полученный экстракт центрифугировали 20 мин при 3500 об./мин, затем супернатант переносили в пробирки Eppendorf объемом 1.5 мл и вторично центрифугировали 10 мин при 12000 об./мин. В су-пернатанте определяли количество HBs-антигена
РУКАВЦОВА и др. Kpnl Salí
RB
.XbaI .baI
A -^ocs A -^ocs A -^ocs A P ^ma^ mas TL HBsAg ag s-ter P L nos nptII pAg7
LB
pE1802-Ag
Xhoí Smaí
RB
/XbaI .baI
A ocs A ocs A ocs A P mas mas ADH HBsAg ag s-ter P nos nptII pAg7
LB
pE1945-Ag
Рис. 1. Схема рекомбинантных плазмид, содержащих ген HBsAg в составе бинарных векторов для трансформации растений - pE1802 и pE1945.
Aocs - активатор гена ocs; Amas - активатор гена mas; TL - энхансер; Pmas - промотор гена mas; Pnos - промотор гена нопалинсинтазы; ags-ter и pAg7 - сигналы полиаденилирования и терминации генов агропинсинтазы и Ag7 соответственно; ADH - интрон гена алкогольдегидрогеназы кукурузы; HBsAg - ген поверхностного антигена вируса гепатита В; nptII - ген неомицинфосфотрансферазы II; RB, LB - правая и левая границы Т-ДНК.
Рис. 2. ПЦР-анализ ДНК трансгенных растений табака, содержащих ген поверхностного антигена вируса
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.