научная статья по теме ТРАНСФОРМИРОВАННАЯ ГЕНОМ HSP101 КУЛЬТУРА КЛЕТОК ТАБАКА ОБЛАДАЕТ ПОВЫШЕННОЙ ВЫЖИВАЕМОСТЬЮ ПРИ ЗАРАЖЕНИИ CLAVIBACTER MICHIGANENSIS SSP. SEPEDONICUS Математика

Текст научной статьи на тему «ТРАНСФОРМИРОВАННАЯ ГЕНОМ HSP101 КУЛЬТУРА КЛЕТОК ТАБАКА ОБЛАДАЕТ ПОВЫШЕННОЙ ВЫЖИВАЕМОСТЬЮ ПРИ ЗАРАЖЕНИИ CLAVIBACTER MICHIGANENSIS SSP. SEPEDONICUS»

ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2013, том 450, № 5, с. 621-623

ОБЩАЯ БИОЛОГИЯ

УДК 546.16:581.143.6

ТРАНСФОРМИРОВАННАЯ ГЕНОМ &р101 КУЛЬТУРА КЛЕТОК ТАБАКА ОБЛАДАЕТ ПОВЫШЕННОЙ ВЫЖИВАЕМОСТЬЮ ПРИ ЗАРАЖЕНИИ Qavibacter michiganensis ssp. sepedonicus

© 2013 г. Т. Н. Шафикова, Ю. В. Омеличкина, А. С. Солдатенко, А. Г. Еникеев, Т. В. Копытина, Т. М. Русалёва, О. Д. Волкова

Представлено академиком М.А. Грачевым 04.07.2012 г. Поступило 28.01.2013 г.

БО1: 10.7868/80869565213170271

Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus (Cms) — фитопатоген, вызывающий у картофеля (растение-хозяин) заболевание "кольцевой гнили", а у табака (растение-нехозяин) — реакцию сверхчувствительности (СЧ-реакция). Патоген-индуци-руемая реакция сверхчувствительности у растений табака является программируемой гибелью клеток (ПГК) в отличие от неуправляемой клеточной гибели у растений картофеля, возникшей в результате развития болезни. В исследованиях на модельных системах — на суспензионных культурах клеток картофеля и табака — показано, что вызываемая Cms гибель клеток культур происходит по тем же механизмам, что и клеток целых растений [1]. Предобработка данных культур умеренно высокой температурой 37°С (тепловой стресс) в течение 2 ч способствовала их выживанию при последующем заражении патогеном; причем выживаемость клеток повышалась независимо от типа гибели, вызываемой патогеном [2]. Известно, что тепловой стресс вызывает активацию синтеза белков теплового шока (БТШ; англ. Heat Shock Proteins, HSP), что способствует последующей устойчивости растений к действию повреждающих температур (феномен индуцированной термотолерантности) [3]. Есть сведения, что искусственное изменение уровня БТШ в результате трансгеноза повышает устойчивость растений не только к повреждающему тепловому шоку, но и к действию других стрессоров [4]. Представляло интерес выяснить, влияет ли сверхэкспрессия белка HSP101 в клетках трансформированных культур табака на их выживаемость при заражении фитопатогеном Cms.

Сибирский институт физиологии и биохимии растений Сибирского отделения Российской Академии наук, Иркутск

Целью работы являлся сравнительный анализ выживаемости нормальной и трансформированной геном hsp 101 культур клеток табака при их инфицировании патогеном Cms.

В результате проведенных исследований впервые показано, что клетки суспензионной культуры табака Nicotiana tabacum (L.), трансформированные геном hsp101, проявляли значительно большую выживаемость при инфицировании их фитопатогеном Cms по сравнению с клетками нормальной культуры.

Растения табака (N. tabacum L.) были трансформированы Agrobacterium tumefaciens штамм LBA 4400, несущей вектор pBiCaMV c генами npt и hsp101 в сенсовой ориентации под управлением 358-промотора, кодирующего белок теплового шока HSP101 из Arabidopsis thaliana (L.) Heyn. [5]. Трансформацию растений проводили путем ко-культивации листовых дисков табака с агробакте-риальной культурой по стандартному методу [6]. Отбор трансформантов проводили на селективной среде с канамицином (100 мг/л); трансгенная природа регенерантов То подтверждена ПЦР на наличие генов nptII (рис. 1). Экспрессия целевого гена hsp101 в трансформированной культуре клеток подтверждена иммуноблоттингом с антителами против белка HSP101 (рис. 2) по стандартному методу [7, 8].

Суспензионные культуры клеток, полученные из мезофилла листа нормальных и трансформированных растений, выращивали согласно методу, описанному ранее [9].

Культура бактерий Cms штамма Ac1405 получена из Всероссийской коллекции микроорганизмов (г. Пущино). Бактерии выращивали в темноте в течение трех суток при температуре 26°С в жидкой среде C [10]. Для инфицирования в колбы с 3-су-точными культурами клеток табака вносили ино-кулюм бактериальной культуры (титр 1 х 107 КОЕ) или среды в том же объеме (контроль). Для экспе-

622

ШАФИКОВА и др.

670 п.о.

12 3 4

Рис. 1. Амплификация гена пр1 в культурах клеток табака, трансформированных А. Ште1аиеш штамм ЬБЛ 4400 (вектор рБЮаМУ с генами npt и Л^р 101). 1 -маркёр (100-1000 п.о.); 2-4 — трансформированная культура клеток табака.

(а) (б)

NN №С1

26°С 37 °С 26 °С 37 °С

Рис. 2. Уровень белка Н8Р101 в культурах клеток табака при температурах культивирования 26°С, 37°С. NtN — нетрансформированная (нормальная) культура; №С1 — культура, трансформированная геном Лр101.

Выживаемость, % от контр.

90 г

Продолжительность кокультивирования, ч

Рис. 3. Влияние С. michiganensis ssp. sepedonicus на выживаемость культур клеток табака. NN — нетрансформированная (нормальная) культура, №С1 — культура, трансформированная геном hsp101 в сенсовой ориентации.

риментов использовали растительные и бактериальные культуры, находившиеся в логарифмической фазе роста. Кокультивировали в темноте при покачивании и температуре 26°С. Выживаемость культур растительных клеток оценивали по реакции восстановления 2,3,5-трифенилтетразо-лия хлористого (ТТХ) [11] в течение трех суток после внесения бактерий с интервалом 6 ч. Эксперименты проводили в трех биологических и пяти аналитических повторностях.

Согласно полученным результатам, инсерция А«р101 в геном табака приводила к сверхэкспрессии белка Н8Р101: его уровень в трансформированной культуре (рис. 2б) был значительно выше, чем в контрольной (рис. 2а). Более интенсивный синтез Н8Р101 в клетках трансформированной культуры табака сопровождался повышенным выживанием клеток при заражении патогеном (рис. 3). Так, гибель клеток нормальной культуры наступала в течение 24—36 ч после заражения патогеном, в то время как жизнеспособность клеток трансформированной культуры сохранялась на протяжении всего опыта и определялась спустя 72 ч после заражения. Полученные результаты согласуются с данными о том, что тепловой стресс, вызывающий активацию синтеза и накопление БТШ в клетках растительных культур, также способствует их выживанию при последующем заражении патогеном. При этом их жизнеспособность повышалась независимо от типа гибели клеток, вызываемой патогеном, — будь то неконтролируемая гибель клеток картофеля в результате болезни или ПГК табака [2]. Таким образом, можно полагать, что увеличение уровня белков теплового шока как в результате трансформации, так и в результате действия теплового стресса способствует выживанию клеток при заражении независимо от типа гибели, вызываемого патогеном. Известно, что синтез БТШ важен не только для защиты клеток при воздействии высокой температуры. В настоящее время установлено, что эти белки накапливаются и участвуют в защите растений при воздействии низких температур, тяжелых металлов, засухи [12, 13]. Имеются сведения, что искусственно повышенный уровень белков БТШ в результате трансгеноза влияет на устойчивость растений к повреждающему тепловому шоку, а также к засолению и осмотическому стрессу [4]. В наших предыдущих исследованиях было установлено, что культуры клеток табака, трансформированные геном А«р101, проявляли повышенную устойчивость к фториду калия [9]. Известно, что при различных стрессовых воздействиях в первую очередь повреждаются белковые молекулы и что основная функция БТШ — это участие в их восстановлении. Неспецифичность различных стрессоров может объясняться одинаковой направленностью их действия на повреждение белков и, следовательно, одинаковым воздействи-

ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК том 450 № 5

2013

ТРАНСФОРМИРОВАННАЯ ГЕНОМ hsp 101

623

ем белков-шаперонов, направленным на их восстановление. Кроме того, нельзя исключить факта, что сам процесс трансформации (инсерция в геном табака чужеродного гена hsp101 из араби-допсиса) является для растения стрессом, который индуцирует быстрое развитие неспецифических защитных реакций к другому стресс-фактору — инфицированию патогеном, т.е. реализуется механизм кросс-резистентности [14, 15].

Рассмотренные данные, а также результаты предыдущих наших работ [9] позволяют считать, что высокий уровень белка HSP101 у трансформированной культуры клеток табака способствует их выживанию при действии Cms и, вероятно, других стрессоров путем восстановления структуры, а значит и функций поврежденных белковых молекул. В результате обеспечивается неспецифическая устойчивость трансгенов к стресс-факторам различной природы.

Авторы статьи выражают благодарность E. Vi-erling (University of Arizona, США) за любезное предоставление генно-инженерной конструкции для трансформации растений и Е.Г. Рихванову за предоставление антител к HSP101 для проведения иммуноблоттинга.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Омеличкина Ю. В., Шафикова Т.Н., Рихванов Е.Г. и др. // Изв. ИГУ. Сер. Биология. Экология. 2008. Т. 1. № 1. С. 63-67.

2. Омеличкина Ю.В., Шафикова Т.Н., Рихванов Е.Г. и др. В сб.: Материалы Всерос. науч. конф. "Устой-

чивость организмов к неблагоприятным факторам внешней среды". Иркутск, 2009. С. 335—339.

3. Рихванов Е.Г., Войников В.К. // Успехи соврем. биологии. 2005. Т. 125. № 1. С. 115-128.

4. Ogawa D., Yamaguchi K., Nishiuchi T. // J. Exp. Bot. 2007. У 58. P. 3373-3383.

5. Queitsch C., Hong S.W., Vierling E., Lindquist S. // Plant Cell. 2000. V. 12. № 4. P. 479-492.

6. Генетическая инженерия растений. Лабораторное руководство / Под ред. Дж. Дрейпера, Р. Скотта, Ф. Армитаджа, Р. Уомена. М.: Мир, 1991. 408 с.

7. Timmons T.M., Dunbar B.S. // Meth. Enzymol. 1990. V. 182. P. 679-701.

8. Павлова Е.Л., Рихванов Е.Г., Таусон Е.Л. и др. // Физиология растений. 2009. Т. 56. № 1. С. 78-84.

9. Еникеев А.Г., Копытина Т.В., Семенова Л.А. и др. // ДАН. 2010. Т. 430. № 1. С. 137-139.

10. Meletzus D, Eichenlaub R. // J. Bacteriol. 1991. V. 173. № 1. P. 184-190.

11. Еникеев А.Г., Высоцкая Е.Ф., Леонова Л.А., Гамбург К.З. // Физиология растений. 1995. № 42. № 3. С. 423-426.

12. Колодяжная Я.С., Кочетов А.В., Шумный В.К. // Успехи совр. биологии. 2006. Т. 126. № 5. С. 456461.

13. Титов С.Е., Кочетов А.В., Коваль В.С., Шумный В.К. // Успехи соврем. биологии. 2003. Т. 123. № 5. С. 487-494.

14. Кузнецов Вл.В. Индуцибельные системы и их роль в адаптации растений к стрессорным факторам. Дис. д-ра биол. наук. Кишинев: Ин-т физиологии растений, 1992.

15. Enikeev A.G., Kopytina T.

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Математика»