ОНТОГЕНЕЗ, 2007, том 38, № 1, с. 21-32
^ ГЕНЕТИКА ^^^^^^^^^^^^^^^^
РАЗВИТИЯ
УДК 612.825:[577.95+575322]
ТРАНСГЕН 6А-99 - МОЛЕКУЛЯРНЫЙ МАРКЕР РАЗВИВАЮЩЕЙСЯ СОМАТОСЕНСОРНОЙ КОРЫ МЫШЕЙ
© 2007 г. А. А. Лазуткин, Б. И. Мейер *, К. В. Анохин
Институт нормальной физиологии им. П К. Анохина РАМН 125009 Москва, ул. Моховая, д. 11, стр. 4 *Max Planck Institute of Biophysical Chemistry Am Fassberg 11, D-37077 Göttingen, Germany E-mail: lazalex@yandex.ru Поступила в редакцию 25.10.05 г.
Окончательный вариант получен 13.02.06 г.
Из десятков известных генов, работающих в развивающейся коре, до сих пор не найдено ни одного, экспрессия которого была бы ограничена строго одной функциональной областью коры. Мы обнаружили, что у трансгенной линии мышей 6А-99 экспрессия LacZ-репортерного гена происходит избирательно в соматосенсорной коре головного мозга. В первичной соматосенсорной коре экспрессия локализована в бочонковом поле, включая зону представительства вибрисс, передних и задних лап, челюстей и головы. Кроме того, LacZ-экспрессирующие клетки найдены во вторичной соматосенсорной коре, а также в ядрах гипоталамуса и шва среднего и продолговатого мозга. В коре трансгенная экспрессия впервые появляется на 3-и постнатальные сут и охватывает только область первичной соматосенсорной коры: зоны представительств мордочки, вибрисс и нижней челюсти. На 5-е сут после рождения выраженная экспрессия трансгена 6Ä-99 появляется во вторичной соматосенсорной коре и зоне представительств передних лап. Экспрессия в представительстве задних лап становилась заметной на 7-е сут. Экспрессия трансгена 6А-99 в соматосенсорной коре исчезала к 50-м сут - к возрасту окончательного функционального созревания коры. Полученные результаты свидетельствуют о том, что процессы регуляции транскрипции в развивающейся соматосенсорной коре мышей отличаются от таковых в других областях коры. Трансген 6А-99 может служить специфическим молекулярным маркером развивающейся соматосенсорной коры у мышей и быть использованным для исследования механизмов генетического и эпигенетического контроля функциональной регионализации неокортекса.
Ключевые слова: генная "ловушка", соматосенсорная кора, регионализация неокортекса, постна-тальный онтогенез, гетерохрония.
В современной нейробиологии остро стоит вопрос о механизмах развития различных структур головного мозга, в частности о генетической детерминации регионализации мозга и о роли внешних факторов в его развитии (Krubitzer, Huffman, 2000; Pallas, 2001). Кора млекопитающих является классическим объектом для подобного рода исследований (см. обзоры: Rubenstein, Rakic, 1999; O'Leary, Nakagawa, 2002). Она обладает комплексной организацией и включает в себя около 50 регионов у человека (Brodmann, 1909) и около 20 функциональных областей - у мыши (Ragsdale, Grove, 2001), отличающихся друг от друга клеточным составом, цито-, хемо- и миелоархитектони-кой, входящими и исходящими проекциями. Так как кора головного мозга является филогенетически неоднородной структурой, исследование онтогенетических механизмов становления ее функциональной и структурной гетерогенности является также средством изучения эволюции го-
ловного мозга (Krubitzer, Kahn, 2003; Krubitzer, Kaas, 2005).
В настоящий момент сложились две концепции, объясняющие процессы разделения коры на функциональные области. Согласно "модели протокарты" (Rakic, 1988), регионализация происходит в первую очередь под влиянием внутренних, генетически детерминированных факторов: вентрикулярная зона подразделяется на тангенциальные домены, формирующие "протокарту" будущей коры. В то же время сторонники "модели протокоры" (O'Leary, 1989) говорят о главенствующей роли внешних факторов в процессах неокортикальной регионализации: корковые предшественники "не запрограммированы" становиться нейронами строго той или иной области, а приобретают свою спецификацию вследствие взаимодействий дифференцирующихся нейронов с клеточным окружением и/или специфической афферентации.
Таким образом, в рамках проблемы клеточных механизмов регионализации коры возник вопрос о существовании генов, избирательно экс-прессирующихся в различных областях развивающейся коры (Rubenstein, Rakic, 1999). Существование "протокарты" и ее "перенос" из вентрикулярной зоны в корковую пластинку, а затем и во все слои коры предполагает существование набора специфических молекул, границы распределения которых должны совпадать с будущими анатомическими границами структур. Однако поиски таких генов до сих пор не принесли заметных успехов. Многие из известных генов, активных в развитии, экспрессируются либо по типу градиента (например, Emx1 и Emx2: Gulisano et al., 1996; Mallamaci et al., 1998; Pax6: Walther, Gruss, 1991; Stoykova, Gruss, 1994), либо в нескольких удаленных друг от друга функциональных областях (Lhx2: Porter et al., 1997; Nakagawa et al., 1999), либо их экспрессия охватывает значительную часть коры, включающую разные функциональные области (COUP-TF1, Tbr1 и Id2: Rubenstein et al., 1999; Liu et al., 2000).
В нашей работе описывается экспрессия в-га-лактозидазного трансгенного маркера (LacZ) в мозгу у мышей линии 6А-99, полученных методом генной "ловушки" (gene trapping) (Salminen et al., 1998) в Институте биофизической химии им. М. Планка (Геттинген, Германия). LacZ-маркер в составе вектора IRESPgalNeo(+pA) встраивался случайным образом в неактивную ДНК плюри-потентных стволовых клеток, с использованием которых в дальнейшем были получены линии трансгенных мышей. Конструкция вектора позволяла запускаться маркерной последовательности всякий раз, когда активировался меченный таким образом ген и/или промотор (Salminen et al., 1998). Таким образом, по экспрессии LacZ можно судить о работе маркированного участка генома.
Предварительные данные показали, что у этой линии мышей экспрессия LacZ имеет пространственно ограниченную локализацию в коре головного мозга. Учитывая это, мы поставили следующие задачи: выявить, какие области коры экспрессируют трансген 6А-99 и совпадают ли границы экспрессии трансгена с границами каких-либо функциональных областей коры, а также установить возрастную динамику этой экспрессии.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
В работе использовали 44 мыши в возрасте 0 (n = 3), 1 (n = 4), 3 (n = 5), 5 (n = 6), 7 (n = 6), 14 (n = 5), 21 (n = 6), 30 (n = 5) и 50 (n = 4) постнатальных сут. Трансгенные животные первого поколения были получены с использованием мышей линии NMRI. Дальнейшее разведение и поддержание колонии трансгенных мышей осуществляли на основе линии мышей 129sv. Трансгенную линию поддержи-
вали в соответствии с правилами разведения ин-бредных линий животных.
Определение возраста животных. День рождения принимали за 1-е сут постнатального развития. Если наблюдали момент рождения, возраст животных принимали за нулевые постнатальные сутки.
Генотипирование. Перед экспериментами у животных определяли наличие трансгена. Для ге-нотипирования использовали ДНК, выделенную из хвостов. ZacZ-последовательность амплифици-ровали при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР) и выявляли амплифицированные фрагменты ДНК методом горизонтального гель-электрофореза.
Выделение ДНК (все реагенты фирмы "Sigma", США). Образцы лизировали в растворе про-теиназы К (0.5 мг/мл), приготовленном на буфере, содержащем 0.01M трис-HCl (pH 7.5), 0.01M ЭДТА (pH 8.0), 0.1M NaCl и 0.025%-ный додецид-сульфат натрия в течение 18-20 ч при температуре 56°С. Лизированные образцы центрифугировали в течение 20-30 мин при 13000 об/мин и осаждали из супернатанта ДНК добавлением двойного объема 96%-ного этанола, 1/20 объема 3М NaCH3COO (рН 5.5) и 1/10 объема 5М NaCl. Осадившиеся нити ДНК промывали 70%-ным этанолом, высушивали на воздухе и ресуспенди-ровали в бидистиллированной воде при 37°С и постоянном встряхивании.
Амплификация и выявление LücZ-последова-телъности. Реакционную смесь, включающую в себя 5 X 10-12М/мкл LacZ-специфичных прайме-ров GC105 (TTG GCG TAA GTG AAG CGA C, "IBA GmbH", Германия) и GC106 (AGC GGC TGA TGT TGA ACT G, "IBA GmbH", Германия), 3 X 10-9М смесь дезоксирибонуклеотидов ("Силекс М", Россия) и 0.5 ед/реакцию Taq ДНК-полимеразы ("Силекс М", Россия), готовили на буфере для Taq/Tth ДНК-полимеразы ("Силекс М", Россия). К 49 мкл реакционной смеси добавляли 1 мкл ресуспедиро-ванной ДНК и амплифицировали в ПЦР-ампли-фикаторе ("Hybaid", США) в следующем режиме: денатурация при 95°C - 2 мин, далее 30 циклов: 56°C - 30 с, 72°C - 1 мин, 95°C - 50 с; заключительные отжиг с праймерами (56°C - 30 с) и элонгация (72°C - 10 мин). Амплифицированные пробы подвергали электрофорезу в 1%-ном агароз-ном геле ("Sigma", США) в TAE-буфере, содержащем 0.5 мкг/мл бромистого этидия ("Carl Roth GmbH", Германия), и анализировали в проходящем ультрафиолетовом свете.
Приготовление препаратов. Паттерны экспрессии трансгена бА-99 и его возрастную динамику исследовали на тотальных препаратах коры у мышат в возрасте 0, 1, 3, 5, и 7 сут и на блоках головного мозга толщиной 2-3 мм у животных в возрасте 3, 14, 21, 30 и 50 постнатальных сут.
Животных умерщвляли транспозицией шейного позвонка, извлекали мозг и затем либо делали его тотальные препараты (кора и блоки), либо изготавливали тангенциальные серийные срезы. Блоки толщиной 2-3 мм нарезали из нефиксированного мозга скальпелем, смоченным физиологическим раствором. Для получения препаратов целой коры извлеченный мозг разрезали пополам в сагиттальном направлении и затем лезвием скальпеля отделяли кору от подкорковых структур. Для приготовления тангенциальных срезов коры полушария зажимали между двумя предметными стеклами и замораживали в парах жидкого азота. Тангенциальные срезы толщиной 40 мкм изготавливали на криостате-микротоме Microm HM505E ("Microm", Германия) при температуре -15 ... -18°C. Срезы помещали на стекла, покрытые поли-£-лизином ("Sigma", США), и перед гистохимическими реакциями подсушивали.
Гистохимическое выявление ¡5-галактозида-зы. Места экспрессии трансгена 6А-99 определяли методом гистохимического выявления внутриклеточной в-галактозидазы с помощью X-gal (5-бромо-4
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.