ГЕНЕТИКА РАСТЕНИЙ
УДК 575.1:582.951.4
ТРАНСГЕННЫЕ РАСТЕНИЯ КАРТОФЕЛЯ БЕЛОРУССКИХ СОРТОВ, ЭКСПРЕССИРУЮЩИЕ ГЕНЫ АНТИМИКРОБНЫХ ПЕПТИДОВ ЦЕКРОПИН-МЕЛИТТИНОВОГО ТИПА
© 2010 г. Н. Л. Вутто, Т. А. Гапеева, А. Н. Пундик, Т. Г. Третьякова, И. Д. Волотовский
Институт биофизики и клеточной инженерии Национальной академии наук Беларуси, Минск 220072, Беларусь;
e-mail: gapeeva@biobel.bas-net.by Поступила в редакцию 01.12.2009 г.
Сконструированы бинарные векторы для агробактериальной трансформации, содержащие кассеты для экспрессии антимикробных пептидов цекропин-мелиттинового типа в растениях под контролем промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты. Для клеток E. coli и Agrobacterium tumefa-ciens показано, что клонирование данных кассет в векторах на основе плазмиды pBI121 с делетиро-ванной последовательностью гена ß-D-глюкуронидазы возможно только в ориентации, противоположной по сравнению с исходным вектором. Получены трансгенные растения картофеля сортов белорусской селекции Одиссей, Ветразь, Скарб, в клетках которых экспрессируются гены пептидов цекропин-мелиттинового типа MsrAl или CEMA. Показано, что эта экспрессия сопровождается повышенной устойчивостью к бактериальному (Erwinia carotovora) и очень высокой устойчивостью грибному (Phytophtora infestans, Alternaria solani) заражению.
Катионные антимикробные пептиды (КАП) — класс макромолекулярных пептидных антибиотиков, привлекающий особое внимание в связи с проблемой резистентности микроорганизмов к традиционным антиботикам [1—3]. Этот класс объединяет пептидные антибиотики размером до 10 кДа с широким спектром антимикробного действия, которые, в отличие от других типов пептидных антибиотиков, синтезируются на рибосомах про- и эукариотических клеток. Отличительные черты КАП — суммарный положительный заряд и амфифильность — обеспечивают основной механизм действия КАП, а именно нарушение целостности биомембран и лизис клеток [4]. Кроме антибактериального и фунгицидного действия некоторые антимикробные пептиды (АП) обладают антивирусной активностью и могут оказывать цитотоксическое действие, в частности, на клетки опухолей и сперматозоидов [4], или являться токсинами ядов, разрушающими мембраны не только про-, но и эукариотических клеток (например, мелиттин и мастопаран). Кроме того, КАП выполняют функции сигнальных молекул, митогенов, участвуют в процессах репарации тканей и др. [5—7]. Катионные антимикробные пептиды многоклеточных организмов прежде всего участвуют в первичных реакциях защиты от патогенных микроорганизмов и являются частью врожденной иммунной системы [8]. Синтез специфичных наборов КАП обеспечивает гибкость адаптации организма-хозяина к определенному спектру патогенных микроорганизмов [9]. В частности, известные природные КАП рас-
тений относятся к типу дефензинов и тионинов, действие которых ограничено кругом фитопато-генов, специфичных для клеток растения-хозяина. В настоящее время созданы и постоянно пополняются базы данных, содержащие сведения о природных КАП из различных источников [5].
Практическое применение КАП основано как на использовании природных антимикробных пептидов, так и на разработке синтетических аналогов [10]. Однако высокая стоимость КАП, получаемых из природных источников и путем химического синтеза, является существенным препятствием для практического применения АП. В этой связи актуальным является использование генно-инженерного синтеза. Особый интерес представляет использование для получения КАП трансгенных растений, которые считаются экономически выгодными, дающими наиболее безопасную продукцию биореакторами [11]. Кроме того, в последние годы интенсивно исследуются возможности усиления защитных свойств растений на основе генно-инженерного синтеза гете-рологичных, в том числе синтетических КАП, так как при сверхэкспрессии эндогенных КАП увеличивается вероятность появления резистентных к этим пептидам патогенных штаммов. С синтетическими КАП, последовательности которых в определенной степени отличаются от природных аналогов, связываются надежды на решение таких проблем генно-инженерного синтеза, как протеолитическая деградация гетерологичных антимикробных пептидов ферментами клеток растения-хозяина, а также возможное возникно-
1626
Олигонуклеотидные праймеры, использованные в работе
Праймер Нуклеотидная последовательность Локализация Температура отжига, °C
NPTS F 5'-cttgctcctgccgagaaagtctcc Синтетический ген неомицин-фосфотрансферазы 58
NPTA R 5'-cggcaagcaggcatcgccatgtgtc
Act S F 5'-catggtattgtcagcaattg 1ен актина картофеля 49
Act A R 5'-ccacgttcagtgaggatc
MCS F 5'-gtggaagctttttaagaagattgg Нуклеотидные последовательности МЗЫ и СЕМА 51
MCA R 5'-aagcttaagagcaggaagtcaag
PBIS F 5'-catttcatttggagagaacacg Т-область бинарного вектора рВ1121
BINS R 5'-aaacagctatgaccatgatt Т-область бинарного вектора рВ!№9 55
BINA R 5'-acgacgttgtaaaacgacgg
вение перекрестной резистентности патогенов к эндогенным КАП [12].
Антимикробные пептиды цекропин-мелитти-нового типа представляют собой синтетические гибридные молекулы на основе цекропина A куколок гигантского шелкопряда и мелиттина из яда медоносной пчелы [13]. Разработаны антимикробные цекропин-мелиттиновые пептиды с антибиотической активностью по отношению к ряду инфекций человека, в частности, малярийной, которые утратили токсичность, связанную с присутствием остатка мелиттина, и являются безопасными для млекопитающих даже при концентрациях, более чем в 20 раз превышающих действующие [13—18]. В то же время показано, что КАП цекропин-мелиттинового типа эффективно ингибируют рост грибных фитопатогенных микроорганизмов [19]. Кроме того, экспрессия таких цекропин-мелиттиновых пептидов, как MsrA1 и CEMA, в клетках растений табака и картофеля сортов Desiree и Russet Burbank сопровождается повышением устойчивости к грибным фитопато-генам Phytophtora cactorum и Fusarium solani, а также к бактериальному заражению Erwinia carotovo-ra [20, 21]. При этом у трансгенных растений картофеля сорта Russet Burbank, экспрессирующих ген MsrA1, наблюдались морфологические изменения листьев и клубней, характерные для реакции сверхчувствительности, возникающей в ответ на заражение. Таким образом, система расте-ние-хозяин-гетерологичный АП имеет свои особенности, и исследование экспрессии цекро-пин-мелиттиновых АП в клетках растений различных хозяйственно-ценных сортов картофеля представляет не только практический, но и научный интерес. Целью данной работы было получение трансгенных растений белорусских сортов картофеля, экспрессирующих гены антимикробных пептидов CEMA [22] и MsrA1 [21]. Поскольку такие растения предполагается в перспективе
использовать для создания линий с усиленными иммунными свойствами и в качестве растений-биореакторов, то в данной работе были применены конструкции для экспрессии под контролем конститутивного промотора.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Растения картофеля Solanum tuberosum L. сортов белорусской селекции Одиссей, Ветразь, Скарб, регенерированные из меристемной ткани, были получены из Научно-практического центра Национальной академии наук Беларуси по картофелеводству и плодоовощеводству (пос. Самохва-ловичи, Минский р-н). Растения in vitro культивировали при температуре 20—22°C с 16-часовым фототопериодом (200 мкм м-2 с-1; лампы LF 35W/54-765, Philips, Польша).
Нуклеотидные последовательности были синтезированы и клонированы в плазмиде pUC19 [23] (Евроген Ру, Москва).
Олигонуклеотидные праймеры были синтезированы в "Праймтех" (г. Минск). Дизайн прайме-ров проводили с использованием программы "Vector NTI" (Инвитроген, США). ПЦР проводили с использованием LC Taq полимеразы, буфера High fidelity из набора реагентов для ПЦР с высокой точностью встраивания нуклеотидов ("Фер-ментас", Литва) в термоциклере My cycler ("Био-Рад", США). Для ПЦР с использованием колоний бактериальных клеток около 1 мкл материала колонии суспендировали в 10-50 мкл воды, очищенной системой Millipore, а затем для лизиса клеток и инактивации дезоксирибонуклеаз пробу прогревали на кипящей водяной бане в течение 5 мин или проводили ПЦР с использованием режима "горячий старт" и предварительной денатурации при 95°C в теченда 5 мин. Праймеры, использованные в работе, представлены в таблице.
Гидролиз ДНК проводили с использованием эндонуклеаз рестрикции производства "Фермен-тас" (Литва) по протоколу фирмы-изготовителя. Фрагменты ДНК выделяли из агарозного геля с использованием набора реагентов "GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit" (Амершам).
Клонирование фрагментов ДНК в векторах проводили по стандартным методикам согласно лабораторному руководству [24] с использованием ферментов производства фирмы "Ферментас".
Бинарные векторы вводили в клетки E. coli и A. tumefaciens методом трансформации [24, 25]. В работе использовали штамм E. coli DH5a [24] и Agrobacterium tumefaciens AGLO [26].
Анализ ДНК проводили методом электрофореза в агарозном геле [24]. Для ПЦР-продуктов с праймерами NPT и Act использовали 1.7%-ную концентрацию агарозы, а для ПЦР-продуктов с праймерами МС — 5%-ную концентрацию. Окрашенные с помощью бромистого этидия нуклеиновые кислоты визуализировали при просмотре гелей в УФ-свете на приборе "ГельДок 2000" (Био-Рад, США). Размеры определяли путем сравнения с маркерными линейными фрагментами ДНК производства "Ферментас".
Трансформацию растений картофеля осуществляли методом инокуляции эксплантов растений агробактериями. В качестве эксплантов использовали фрагменты междоузлий без пазушных почек 3—44-недельных растений картофеля, выращенных in vitro. В одном эксперименте ино-кулировали в среднем 60 эксплантов. Основой сред для каллусо- и побегообразования была стандартная агаризованная (0.8%) среда Мураси-ге—Скуга с витаминами [27], содержащая 30 мг/л сахарозы. Концентрации гормонов в средах составляли: 1 мг/л BAP (6-бензиламинопурин), 0.1 мг/л NAA (1-нафтилуксусная кислота) и 0.1 мг/л GA3 (гибберелловая кислота) для стимуляции образования каллуса и 1 мг/л BAP, 0.1 мг/л GA3 для образования побегов [28]. Концентрации антибиотиков в средах для регенерации составляли: 25 мг/
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.