ГЕНЕТИКА РАСТЕНИЙ
УДК 577.321:577.214:57.052
ТРАНСГЕННЫЕ РАСТЕНИЯ ТОМАТА, ЭКСПРЕССИРУЮЩИЕ ГЕНЫ recA И NLS-recA-licBM3, КАК МОДЕЛЬ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ МЕЙОТИЧЕСКОЙ
РЕКОМБИНАЦИИ
© 2010 г. Р. А. Комахин1, В. В. Комахина1, Н. А. Милюкова1, 2, И. В. Голденкова-Павлова3, О. А. Фадина1, А. А. Жученко3
1 Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии
Россельхозакадемии, Москва 127550; e-mail: recombination@iab.ac.ru 2 Российский государственный аграрный университет — МСХА имени К.А. Тимирязева, Москва 127550 3 Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова, Москва 119991
Поступила в редакцию 16.03.2010 г.
У эукариот гомологичная рекомбинация ДНК необходима для поддержания стабильности и целостности генома, а в мейозе также для правильной сегрегации хромосом и формирования новых гаплотипов. В тоже время генетическая детерминированность и не случайность мейотической рекомбинации ограничивают интрогрессию генов и получение уникальных генотипов. В качестве одного из подходов для изучения и индукции мейотической рекомбинации у растений предлагается использовать ген recA Escherichia coli. Показано, что гены recA и NLS-recA-licBM3 наследуются по материнской линии и экспрессируются в потомстве трансгенных растений томата. Растения, экс-прессирующие гены recA или NLS-recA-licBM3 и содержащие одну инсерцию Т-ДНК, по фертиль-ности пыльцы не отличаются от исходных не трансгенных форм и поэтому могут быть использованы для сравнительного изучения влияния бактериальных рекомбиназ на мейотическую рекомбинацию между сцепленными генами.
Гомологичная генетическая рекомбинация в клетках про- и эукариот необходима для стабильности и целостности генома. Функционирование гомологичной рекомбинации основано на репарации двухцепочечных разрывов ДНК, которая является элементарным биологическим механизмом, обеспечивающим нормальную работу репли-кативных вилок у про- и эукариот [1—4]. Потребность в немутагенной репарации повреждений ДНК является наиболее удачным объяснением развития систем рекомбинации во всех доменах живого [5, 6].
В мейозе гомологичная генетическая рекомбинация приводит к созданию хиазм — крестообразных структур, сформированных в результате кроссинговера, которые физически удерживают гомологичные хромосомы, позволяя им правильно распределиться между дочерними клетками и обменяться гомологичными участками. Считается, что обмен между гомологами является малозначимым следствием мейотической рекомбинации, поскольку генетическое разнообразие может быть обеспечено перекомбинированием отдельных хромосом [7]. Такая ситуация с точки зрения практической селекции недостаточна, поскольку часто необходимо получить искомый генотип (сорт или линию), сочетающий несколько сцеп-
ленных генов, находящихся в гомологичных хромосомах.
Детерминированность точек инициации крос-синговера в профазе I мейоза при внутривидовых скрещиваниях и нарушение сегрегации хромосом у отдаленных гибридов, приводящее к их стерильности, существенно ограничивают интро-грессию генов и получение уникальных генотипов [8, 9]. Изменение частот рекомбинации между гомо- и гомеологичными хромосомами может повысить эффективность селекционных методов. Последнее обстоятельство особенно важно при интрогрессивной гибридизации, ставящей своей целью перенос генов адаптивно-значимых и хозяйственно-ценных признаков из хромосом дикорастущих видов в хромосомы культурных растений [8—10].
Значительная часть современных исследований мейотической рекомбинации у растений сконцентрирована на изучении мутантов араби-допсиса, полученных методом ДНК-инсерцион-ного мутагенеза [11—13]. Стратегия "выключения" отдельных генов помогла исследовать круг ферментов, необходимых для мейотической рекомбинации, но не позволила оценить их влияние на частоту мейотической рекомбинации (г!) между сцепленными генами, поскольку большая часть мутантов была стерильна.
1635
4*
В нашей лаборатории для изучения мейотиче-ской рекомбинации было предложено использовать трансгенные растения томата, экспрессиру-ющие гены, белковые продукты которых участвуют в рекомбинации. Молекулярный процесс гомологичной рекомбинации требует как минимум поиска гомологии и обмена нитями между двумя молекулами ДНК. У эукариот основным фактором, способным в соматических клетках и в микроспороцитах осуществить оба этих процесса, является рекомбиназа Rad51 [11—14]. Однако белку Rad51 для эффективной работы требуется участие белков-паралогов Rad51B, Rad51C, Rad51D, Xrcc2, Xrcc3 и Dmc1 [11, 15-17]. В то же время бактериальный белок RecA имеет от 40 до 60% гомологии с эукариотическими рекомбина-зами, но в отличие от них универсален, т.е. способен выполнять разные и даже уникальные функции без участия белков-паралогов и с большей эффективностью [17, 18]. Экспрессия гена recA E. coli в клетках растений табака в 3 раза повышала количество двухцепочечных разрывов ДНК, восстановленных по механизму гомологичной рекомбинации, и более чем в 2 раза увеличивала число сестринских хроматидных обменов [19, 20]. Это позволило нам предположить, что экспрессия recA в клетках растений в профазе мейоза может также изменить число и распределение обменов между гомологичными или гомеологичными хромосомами.
В качестве растительного объекта был выбран томат, поскольку в нашей лаборатории имеется большая коллекция фенотипических и биохимических маркеров этой культуры. Инбредные линии томата, содержащие сцепленные фенотипи-ческие маркерные гены, будут использованы в гибридологических исследованиях для оценки частоты мейотической рекомбинации. Коллекция дикорастущих видов томатов позволит изучить рекомбинацию между гомеологичными хромосомами в мейозе межвидовых гибридов. Кроме того, томат является ценной сельскохозяйственной культурой, поэтому результаты данных исследований приоритетны и в практическом отношении.
Известно, что при трансгенезе инсерция Т-ДНК в функционально-значимые области генома может негативно повлиять на мейоз и фертиль-ность пыльцы [21-23]. Такие трансгенные растения неправомерно применять для анализа мейо-тической рекомбинации между сцепленными генами, поскольку невозможно установить, что окажет на нее решающее влияние - положение Т-ДНК или экспрессия целевого гена.
Настоящая работа основана на создании и изучении трансгенных растений томата, экспресси-рующих гены recA или NLS-recA-licBM3, с использованием которых ставится задача достовер-
но оценить влияние бактериальных рекомбиназ на мейотическую гомологичную или гомеологич-ную рекомбинацию у цветковых растений.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В качестве растительных объектов использованы растения томата сорта Марглоб (Аа, D и Wv) и маркерной линии Мо938 (аа, dи wv), содержащие сцепленные маркерные гены, детерминирующие признаки "отсутствие антоциана" (аа), "карликовость" (d) и "желтая точка роста" (wv) [24]. Получение трансгенных растений томата проводили согласно ранее опубликованным данным [25] с некоторыми модификациями. В частности, ко-культивацию семядольных эксплантов томата с агробактериями проводили газонным методом в темноте в течение 72 ч при температуре 20°С. Для селекции трансгенного каллуса и получения реге-нерантов использовали канамицин в концентрации 35 мг/л, а для отбора трансформированных побегов — 100 мг/л.
Для трансформации растений был использован штамм агробактерий AGL0, содержащий растительный экспрессионный вектор pBI121 с генами recA или NLS-recA-licBM3 под контролем 35S промотора [26].
Молекулярно-биологический анализ первичных трансформантов и гибридов F1 растений томата проводили методами ПЦР с использованием разработанных нами праймеров ("Синтол", Россия) (табл. 1).
Выделение геномной ДНК из растений проводили с помощью цетилтриметиламмоний-^бро-мида ("Sigma", США), а тотальной РНК — с использованием "TRI Reagent" ("Sigma", США). Для получения кДНК использовали олигонук-леотид dT(18) (табл. 1) и обратную транскриптазу M-MuLV ("Fermentas", Литва). Для определения размера фрагментов ДНК в качестве маркера использовали GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder (SM1333) ("Fermentas", Литва).
Репортерный ген licBM3, кодирующий термостабильную лихеназу Clostridium thermocellum, любезно предоставлен профессором Э.С. Пирузян (ИОГен РАН). Определение активности лихеназы в растениях проводилось согласно [26, 27]. Экстракцию белка из листьев растений томата, экс-прессирующих ген NLS-recA-licBM3, проводили 0.1 М Na-фосфатным буфером рН 7.5, содержащим 0.5 М хлористого натрия. В качестве контроля при проведении молекулярно-биологических и биохимических экспериментов были использованы не трансгенные растения томата соответствующего генотипа. Фертильность пыльцы определяли ацетокарминовым методом [28]. Расчет НСР и статистическая проверка гипотезы по
Таблица 1. Праймеры для молекулярно-биологического анализа растений
Ген Праймер 5'-3' Продукт ПЦР, пн
virE2 virE(plus) cgaatacattctcgtgcgtcaaacg 600
virE(minus) tttcgagtcatgcataatgcctgac
recA* recA(plus) ggatccatggctatcgacgaaaacaaacagaaag 626
R(minus) ccgaacatcacaccaattttcat
recA** recA(plus) ggatccatggctatcgacgaaaacaaacagaaag 1062
recA(minus) agatctaaaatcttcgttagtttctgctacgc
NLS-recA-licBM3* NLS(plus) ggatccatgccaccaaagaagaagagaaaggttgaaata 671
R(minus) ccgaacatcacaccaattttcat
recA dT(18) tttttttttttttttttt
* Использованы при анализе ДНК первичных трансформантов томата. ** Использованы при анализе транскрипции гена recA в первичных трансформантах и гибридах томата.
критерию х2 выполнены согласно методическим рекомендациям [29].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Для переноса и экспрессии в растениях томата использовали нативный ген recA E. coli [26]. Следует отметить, что recA кодирует белковый продукт, выявить который из совокупности других клеточных белков возможно только при использовании специфических антител или слитого с ним трансляционного репортера. В качестве ре-портерного гена использовали ген licBM3, кодирующий термостабильную лихеназу C. thermocel-lum (см. Материалы и методы), поскольку его применение в качестве трансляционного репортера позволяет бы
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.