ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2007, том 54, № 2, с. 209-216
УДК 581.1
ТРАНСПОРТ МЕТАБОЛИТОВ ЧЕРЕЗ ПЕРИБАКТЕРОИДНУЮ МЕМБРАНУ В ОНТОГЕНЕЗЕ БОБОВ
© 2007 г. В. В. Крылова, П. Н. Дуброво, С. Ф. Измайлов
Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, Москва
Поступила в редакцию 10.04.2006 г.
Изучена временная организация транспортной функции перибактероидной мембраны (ПБМ) с использованием спектрофотометрической регистрации действия углерод- и азотсодержащих субстратов (малата, сукцината и глутамата) на закисление перибактероидного пространства и интенсивность светорассеяния симбиосом разновозрастных корневых клубеньков бобов (Vicia faba L.). На ранних этапах формирования и функционирования клубеньков ПБМ проницаема не только для малата и сукцината, но и для глутамата, что полноценно обеспечивает активное деление бактероидов и синтез в них нитрогеназного комплекса на основе С- и N-содержащих субстратов. В зрелых клубеньках, характеризующихся наиболее высокой азотфиксирующей активностью, ПБМ избирательно проницаема для малата и сукцината и представляет собой барьер для глутамата, определяя тем самым взаимовыгодность отношений партнеров симбиоза. В стареющих клубеньках перестройка взаимоотношений симбионтов направлена на минимальное поглощение бактероидами как С-, так и N-метаболитов. Сделан вывод, что транспортная функция ПБМ в процессе онтогенеза бо-бово-ризобиального симбиоза не статична и определяет качественно различный характер взаимоотношений партнеров симбиоза в ряду: паразитизм-мутуализм-комменсализм.
Vicia faba - клубенек - симбиосома - перибактероидная мембрана - транспорт метаболитов - онтогенез
ВВЕДЕНИЕ
Формирование внутриклеточного азотфикси-рующего симбиотического комплекса у растений сопровождается образованием разделяющей макро- и микросимбионтов перибактероидной мембраны (ПБМ), которая играет ключевую роль в их взаимоотношениях [1-3]. ПБМ является по происхождению симбиотической, так как ее биогенез осуществляется посредством дифференцированной экспрессии генов обоих партнеров бо-бово-ризобиального симбиоза при биосинтезе но-дулинов, бактероидинов, ЖК, полисахаридов и др. компонентов [1]. На стадии эффективной азот-фиксации клубеньков бобовых ПБМ обеспечивает избирательность транспорта метаболитов и ионов, поддерживает необходимый гомеостаз, участвует в реализации сигнальных механизмов
Сокращения: АО - акридиновый оранжевый, ПБМ - перибактероидная мембрана; ПБП - перибактероидное пространство.
Адрес для корреспонденции: Крылова Валерия Валерьевна. 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений РАН. Факс: 007 (495) 977-80-18; электронная почта: nitrogenexchange@mail.ru
различных внутриклеточных процессов в про- и эукариотических клетках [2, 4-6].
Несмотря на существенные достижения в этой области, практически открытым остается вопрос о статичности транспортной функции ПБМ с учетом ее временной (онтогенетической) организации. Наряду с теоретическими аспектами, разработка этой проблемы имеет практический интерес, так как касается понимания механизмов пролонгированного и устойчивого функционирования всей симбиотической системы.
Целью работы было исследование специфики транспортной функции ПБМ в отношении различных углерод- и азотсодержащих метаболитов (малата, сукцината и глутамата) при использовании симбиосом из клубеньков трех возрастных групп: молодых, зрелых и стареющих.
МЕТОДИКА
В работе были использованы растения бобов (Vicia faba L., сорт Русские черные), инокулиро-ванные эффективным штаммом Rhizobium legu-minosarum 23 или 501 (предоставленных докт. Классеном, Латвийский с.-х. университет). Растения выращивали в сосудах с 6 кг кварцевого песка, в кондиционированной оранжерее при отно-
сительной влажности 70%, 25°С и 16-часовом фотопериоде или в вегетационном домике; в обоих случаях - на модифицированной безазотной питательной смеси Кнопа. Азот использовали в виде стартовой дозы 430 мг Ca(NO3)2 на сосуд, микроэлементы вносили по Ринькису [7, с. 232].
Азотфиксирующую активность клубеньков определяли на хроматографе Хром 4 ("KOVO", Чехия), как было описано ранее [8].
Фракцию симбиосом с интактной ПБМ выделяли из клубеньков бобов разных возрастных групп по методу, разработанному в лаборатории азотного обмена ИФР, путем дифференциального центрифугирования в градиенте плотности перкола [9].
Указанные возрастные группы клубеньков идентифицировали по наличию леггемоглобина и нитрогеназной активности. К группе молодых были отнесены клубеньки 12-16-дневных растений в виде вздутий на стержневом корне до 1 мм в диаметре. Сырая масса таких клубеньков, имеющих на данном этапе развития сферическую форму, достигала 17-20 мг на одно растение. У этих клубеньков была белая окраска или только появлялась розовая, что говорило об отсутствии или наличии "следов" леггемоглобина. Нитрогеназная активность в них отсутствовала, либо была низкой (до 1.6 мкмоль С2Н4/(г сырой массы ч)). К зрелым относили клубеньки, полученные от растений на стадии бутонизации-цветения-начала плодоношения, размеры которых превышали 2 мм. Они приобрели продолговатую форму, явно розовую окраску и высокую нитрогеназную активность (18-22 мкмоль С2Н4/(г сырой массы ч)). В фазу закладки бутонов сырая масса клубеньков составляла 40-45 мг на одно растение. К стареющим относили клубеньки растений в фазе зрелых бобов, они имели коралловидную форму и начинали зеленеть, у них появлялась "стареющая", бактеро-идсодержащая зона. При полной зрелости плодов растений клубеньки имели зеленую окраску. У таких растений в клубеньках происходил распад леггемоглобина и отсутствовала нитрогеназная активность, а позднее начинался некроз тканей.
Измерения проводили на спектрофотометре Hitachi 557 (Япония) в двухволновом режиме AA492-540 или AA590-610 в кюветах без перемешивания при комнатной температуре, а также на одной волне 492 нм в двухлучевом - на Specord M40 (Германия) с помощью проникающего АрН-инди-катора - акридинового оранжевого (АО) [10] и потенциал-чувствительного Ay-зонда оксонола VI [11].
Основным подходом при изучении кинетики транспорта указанных метаболитов через ПБМ являлась регистрация вызванного ими воздействия на закисление содержимого перибактеро-идного пространства (ПБП) в бескалиевой среде
инкубации. При помещении симбиосом в бескалиевую среду инкубации движущей силой для импорта Н+ был генерируемый на ПБМ диффузионный калиевый потенциал (отрицательный на внутренней стороне ПБМ). Еще более сильное закисление ПБП создавалось искусственно в присутствии Н+/К+-антипортера - нигерицина. Регистрируя изменение абсорбции проникающего индикатора АО, изучали действие метаболитов на пассивное или искусственно создаваемое нигери-цином закисление ПБП, что свидетельствовало о транспорте метаболитов в симбиосомы.
О переносе метаболитов через ПБМ судили также по изменению градиентов рН (АрН) и мембранного потенциала (Ау), создаваемых в результате работы локализованной на ПБМ Mg-зависи-мой Н+-АТФазы, при добавлении в среду инкубации с интактными симбиосомами АТФ и тот или иной субстрат. Основным маркером интактности ПБМ выделенных симбиосом служил Н+-насос, генерирующий на мембране градиенты АрН (закисление ПБП) и Ау (положительный на внутренней стороне ПБМ) [12].
Транспорт метаболитов в препаратах симбиосом также регистрировали спектрофотометриче-ски на волне 550 нм в двухлучевом режиме по изменению интенсивности светорассеяния суспензии симбиосом в результате их осмотического набухания или сжатия при внесении исследуемых метаболитов в среду инкубации [13].
Основная среда инкубации содержала 0.4 М сорбит, 20 мМ Hepes/BTP(•uc-mpuc-пропан)-бу-фер (рН 6.5 или 7.0) и 4 мкМ оксонола VI или 16 мкМ АО. Концентрации других компонентов, вносимых в инкубационную смесь, указаны в подписях к рисункам.
Концентрацию белка в препаратах симбиосом определяли по методу Bradford [14].
Другие детали экспериментов указаны в разделе Результаты и в подписях к рисункам. в работе использовали сорбит фирмы "Calbiochem" (США); бис-трис-пропан, Hepes, нигерицин фирмы "Sigma" (США); ЭГТА, MES, АТФ, акридиновый оранжевый, малат, сукцинат, глутамат фирмы "Serva" (Германия), оксонол VI фирмы "Molecular Probes" (США). Остальные реактивы отечественного производства квалификации "х.ч.".
РЕЗУЛЬТАТЫ
Молодые клубеньки
На рис. 1 видно, что добавление малата и сук-цината резко стимулировало процесс пассивного закисления ПБП симбиосом из молодых клубеньков после их помещения в бескалиевую среду инкубации. Предварительные расчеты степени диссоциации по величине констант диссоциации при рН 6.5 натриевых солей малата и сукцината пока-
зали, что они присутствуют в среде в форме двух-зарядного аниона. Наблюдаемая кинетика изменения абсорбции АО объяснялась тем, что первоначальное закисление ПБП происходило благодаря формированию на внутренней стороне ПБМ диффузионного калиевого потенциала со знаком "минус" при выходе из симбиосом наружу ионов К+ и последующего импорта в ПБП протонов. По достижении стационарного уровня потенциал вновь генерировался за счет входа аниона дикарбоксилата, что вызывало новую волну поступления Н+ и дальнейшее закисление ПБП. Добавление ^Н4)^04 приводило к сбросу градиента рН. Изменение абсорбции проникающего индикатора АО наблюдали и при добавлении глутамата (рис. 1а).
При добавлении малата и глутамата в среду инкубации с симбиосомами, на фоне искусственно создаваемого нигерицином закисления их ПБП, получили реакцию индикатора АО, выражающуюся в диссипации ДрН (рис. 16). При более низком рН, вызываемом присутствием в среде инкубации К+/Н+-антипортера - нигерицина, малат и глутамат, проникающие в ПБП в анионной форме, протонировались, что приводило к повышению рН.
Положительный ответ на вопрос о возможности транспорта глутамата (наряду с малатом и сукцинатом) через ПБМ получили и при спектро-фотометрической регистрации изменения интенсивности светорассеяния суспензии симбиосом (рис. 1в). Внесение в среду инкубации этих метаболитов вызывало набухание симбиосом. При повторном добавлении глутамата этот эффект усил
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.