ш
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, I99S, том 24, № 4, с. 288-292
УДК 577.152.3.4.21.05.612.115.12
ТРОМБИН - РЕГУЛЯТОР РЕПАРАТИВНЫХ ПРОЦЕССОВ
ПРИ ЗАЖИВЛЕНИИ РАН
© 1998 г. С. М. Струкова#, Т. Н. Душна, И. В. Чистов, К. А. Марквичева*. С. В. Купцова*, Е. Г. Колокольчикова**, Л. Д. Румш*, В. П. Зубов*, Э. Глуза***
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, кафедра физиологии человека и животных, 119899, Москва;
* Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и ¡O.A. Овчинникова РАН, Москва;
**Институт хирургии им. A.A. Вишневского РАМН, Москва;
***Центр сосудистой биологии и медицины Иенского университета им. Ф. Шиллера, Эрфурт, ФРГ
Поступила в редакцию 08.07.97 г. Принята к печати 19.12.97 г.
Тромбин, взаимодействуя с рецепторами семейства PAR (protease-activated receptor), участвует в заживлении ран, индуцируя процессы репарации и регулируя активность тучных клеток, секретирую-щих медиаторы воспаления. При использовании для активации тучных клеток крысТЯАР-б (thrombin receptor agonist peptide) получены доказательства в пользу существования на тучных клетках нескольких рецепторов, в том числе PAR-1. Показано, что TRAP может вызывать повышение концентрации Са2+ в цитоплазме тучных клеток и регулировать дегрануляцию клеток, освобождая окись азота. Установлено, что инкапсулированный в nBK-Ca-Alg-гидрогелевые пленки тромбин стимулирует заживление ран у крыс, о чем свидетельствует ускорение пролиферации фиброблас-тов и неоваскуляризации.
Ключевые слова; тромбин, рецептор, пептиды, тучные клетки, заживление ран.
Тромбин (КФ 3.4.21,5), уникальная сериновая протеиназа семейства трипсина, не только превращает фибриноген крови в фибрин сгустка, но и регулирует свертывающие и противосвертыва-ющие механизмы, сосудистый тонус, участвует в процессах заживления ран [1-6].
Тромбин включается в воспалительную и про-лиферативную фазы заживления ран, при этом он стимулирует адгезию кровяных пластинок, полиморфно-ядерных лейкоците®, моноцитов и Т-лимфоцитов к эндотелиальным клеткам и агрегацию клеток; повышает проницаемость монослоя эндотелиальных клеток и стимулирует пролиферацию клеток эндотелия, фибробластов и Т-лимфоцитов [3, 5, 7]. В первой стадии заживления ран - воспалении - принимают активное участие тучные клетки, которые освобождают медиатор воспаления - гистамин, протеиназы, хемоат-трактанты, гепарин и кофактор основного
Сокращения: DIP - диизопропилфосфорил, cGMP - циклический гуанозинмонофосфат; PAR - рецептор, активируемый протеиназой; TRAP - пептид, агонист тромбиново-го рецептора; ПВК-Ca-Alg - поли-М-винилкапролактам-Са-альгинат.
"Автор для переписки (тел.: (095) 939-14-1 6, факс: (095) 138-09-92, e-mail: strukov@ofefs.phys.msu.su).
фактора роста фибробластов. Тучные клетки синтезируют также фактор роста, который про-мотирует пролиферацию фибробластов [8]. Нами [9, 10] и авторами работы [11] установлено, что тромбин может вызывать дегрануляцию тучных клеток и освобождение гистамина и гепарина. В процессах репарации тканей участвует не только тромбин, образуемый из протромбина крови, но и тромбин другого происхождения: есть данные о синтезе тромбина в макрофагах, в которых обнаружена мРНК протромбина и протром-биназная активность, необходимая для активации профермента [12].
Тромбин в отличие от трипсина проявляет высокую избирательность действия, обусловленную особенностями структуры его молекулы [13]. Кроме активного центра тромбин имеет экзосай-ты, которые мы объединяем понятием "центр узнавания специфических субстратов и рецепторов" [13]. Анионсвязывающий экзосайт 1 отвечает за связывание тромбина с комплементарными участками, рецепторов клеток, фибриногена И некоторых других специфических субстратов. Анионсвязывающий экзосайт 2 отвечает за связывание тромбина с гепарином и гликокалицином [3].
Действие тромбина на клетки реализуется вследствие его взаимодействия с мембранными рецепторами. Один из рецепторов, называемый
PAR-I (protease-actívated receptor), относится к су-терсемейству интегральных мембранных белков -семидоменных рецепторов, сопряженных с G-белками [14, 15J. К этому суперсемейству относятся рецептор],i катехоламинов, ацетилхолина, серотонина, гистамина, ангиотензинов, тахикини-rob, фактора активации тромбоцитов, эндотели-пОв и других агонистов [14, 16]. В отличие от всех вышеупомянутых рецепторов внеклеточный N-концевой фрагмент PAR-1 имеет расщепляемую тромбином пептидную связь Arg41-Ser42 [14]. Укороченный тромбином новый N-концевой фрагмент рецептора человека с последовательностью S4^PLLRNPNDKYEPF, который называют "привязанным лигандом" или TRAP-14 (thrombin receptor agonist peptide), активирует рецептор, взаимодействуя с участками его »торой внеклеточной петли. В процессе узнавания PAR I участвует анионсвязывающий экзосайт 2 тромбина. комплементарный отрицательно заряженному кластеру Y' EPFWEDEE рецептора вблизи расщепляемой тромбином связи [14]. PAR-1 обнаружен на кровяных пластинках, эндотелиальных, гладкомышечпых клетках, фибробластах и дру-: их клетках. Синтетические пептиды TRAP-14 и его 6-членный N-концевой фрагмент S42FLLRN TRAP-6) проявляют тромбиноподобное действие на всех названных выше клетках [1, 2, 5].
После открытия расщепляемого тромбиново-го рецептора (PAR-1) возник вопрос о существовании других рецепторов с подобным механизмом действия. Второй член семейства PAR, именуемый PAR-2, активируется не тромбином, а трипсином и секретируемой тучными клетками триптазой [17-20]. Эти протенпазы расщепляют в PAR-2 мыши связь Arg36-Ser37, а в PAR-2 человека - связь Arg34-Ser35 и освобождают новые N-концевые пептиды SLIGRL и SLIGKV соответственно - агонисты PAR-2. Рецептор PAR-2 продуцируется кератиноцитами, эпителиальными, эндотелиальными и некоторыми формами гладкомышечпых клеток [19].
Недавно в лаборатории Коухлин методами генной инженерии выделен и охарактеризован новый тромбиновый рецептор - PAR-3, который продуцируется клетками разных тканей и может опосредовать участие тромбина в воспалительных и пролиферативных процессах [21]. Пептид TFRGAP, агонист рецептора PAR-3, обнажается после расщепления тромбином пептидной связи Lys38-Thr39 в PAR-3.
Существование двух тромбиновых рецепторов PAR-1 и PAR-3) на клетках, участвующих в репа-ративных процессах, предполагает важную роль тромбина в стимуляции этих процессов. Однако механизмы рецептор-опосредованных реакций, регулируемых тромбином при заживлении ран, еще не расшифрованы, до последнего времени не
было данных о наличии PAR-1 на тучных клетках. Следует отметить, что характер действия тромбина на клетки может существенно меняться в зависимости от концентрации фермента [10. 22, 23]. Это позволило нам высказать предположение о наличии нескольких рецепторов тромбина на тучных клетках.
Ранее для выяснения структурных основ взаимодействия тромбина с тучными клетками мы исследовали действие на перитонеальные тучные клетки модифицированных форм тромбина: D1P-альфа-тромбина (с сохраненным центром узнавания субстратов и рецепторов, но лишенного про-теолитичсской активности вследствие алкилиро-вания серина активного центра) и протеолитиче-ски активного гамма-тромбина (с. нарушенной структурой экзосайтов центра узнавания). Используя методы локальной фиксации потенциала (patch-clamp) и измерения внутриклеточного рН (с флуоресцентным рН-чувствительным зондом), мы показали, что как альфа-тромбин, так и DIP-альфа-тромбин вызывают синхронное дозозави-симое увеличение емкости и проводимости мембраны тучных клеток, двухфазное изменение внутриклеточного рН и зависимую от протеинкина-зы С активацию №+/Н+-обмена [10, 22]. Гамма-тромбин не активировал Na+/11+-обмен в тучных клетках. Это позволило сделать заключение, что часть воздействий тромбина на тучные клетки (проявляемых DIP-альфа-тромбином) отражает по существу его гормоноподобную активность. Но оказалось, что протеолитическая активность фермента важна для стимуляции дегрануляции тучных клеток [10, 11]. Эти факты могли бы свидетельствовать о наличии нескольких' рецепторов тромбина, в том числе PAR-1, на мембране тучных клеток. И действительно, в последнее время, используя для активации тучных клеток TRAP-6, мы получили доказательства существования на тучных клетках семидоменного рецептора тромбина - PAR-1 [24J.
С помощью Са2+-чувствительного флуоресцентного зонда фура-2 [25] мы провели исследование активации тучных клеток альфа-тромбином и пептидом TRAP-6, агонистом PAR-1, имитирующим действие альфа-тромбина на клетки, и обнаружили в обоих случаях повышение внутриклеточной концентрации Са2+. Наблюдаемый эффект был дозозависимым. при этом тромбин проявлял действие в концентрациях на три порядка ниже, чем у TRAP-6 [24]. Поскольку клетки отвечают повышением внутриклеточной концентрации Са:+ на действие агониста рецептора PAR-1, можно заключить, что на тучных клетках существует расщепляемый семидоменный рецептор тромбина.
Вместе с тем существенное различие в эффективных концентрациях тромбина и TRAP-6
4 БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ том 24 №4 1998
290
СХРУКОВА и др.
указывает на то, что для полноценного ответа клеток на тромбин недостаточно наличия только одного РА1<-1. Это свидетельствует в пользу существования на тучных клетках нескольких рецепторов тромбина. Последнее предположение подтверждается приводимыми ниже данными об изменении концентрации сСМР и гистамина в клетках при действии тромбина.
Регуляция секреции клеток может осуществляться сСМР, повышение концентрации которого ведет к стабилизации клетки и уменьшению спонтанной или индуцированной секреции гистамина. Повышение Концентрации сСМР в клетке может происходить вследствие активации гуани-латцйклазы, в частности окисью азота (N0). N0 образуется в клетках в результате окисления гуа-нидшювого азота L-Aтg в реакциях, катализируемых Ж)-синтетазами, которые превращают аргинин в ¿-цитруллин и освобождают N0 [26]. Возможное! ь существования такого механизма в тучных клетках показана в лаборатории Вэйна [27, 28].
В серии экспериментов мы оценивали влияние тромбина на содержание сСМР в тучных клетках (с помощью иммунофе
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.