НЕЙРОХИМИЯ, 2012, том 29, № 3, с. 200-205
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ^^^^^^^^^^^^ РАБОТЫ
УДК 615.21+577.15+612.814
ЦЕРЕБРОВАСКУЛЯРНЫЕ ЭФФЕКТЫ ОБОГАЩЕННОГО ПРОЛИНОМ ПОЛИПЕПТИДА © 2012 г. М. Г. Баласанян1, Э. Л. Ерицян1 *, А. В. Топчян1, С. Т. Карамян1, А. А. Галоян2
Ереванский государственный медицинский университет им. М. Гераци, Ереван, Армения 2Институт биохимии им. Г.Х. Бунятяна, НАНРА, Ереван, Армения
Более 50 лет назад академиком А.А. Галояном было показано, что продукты нейросекреции гипоталамуса участвуют в высвобождении гормонов, регулирующих сердечную деятельность и циркуляцию крови в коронарных сосудах. Из гипоталамуса был выделен белок, обладающий способностью снижать перфузионное давление в позвоночной артерии и тонус сосудов головного мозга после внутривенного введения кошкам. Продемонстрирована способность этого белка расширять кровеносные сосуды головного мозга и сердца. Позднее подобные белки были выделены из нейрогипо-физа различных животных, показан их гормональный характер. Кроме того, А.А. Галояном был идентифицирован обогащенный пролином пептид (ПБП-1, Галармин), состоящий из 15 аминокислотных остатков, проявляющий коронарорасширяющие свойства. Исследования действия ПБП-1 на кровоснабжение мозга в норме и патологии показали его способность восстанавливать кровоток в сосудах мозга после окклюзии общей сонной артерии.
Ключевые слова: обогащенный пролином пептид, коронарорасширяющая активность, кровеносные сосуды, мозг.
ВВЕДЕНИЕ
Прогнозируется, что к 2020 году цереброваску-лярные болезни во всем мире будут занимать четвертое место по смертности после сердечно-сосудистых заболеваний, депрессивных расстройств и автомобильных катастроф [i]. Одним из главных путей регуляции мозгового кровотока (МК) является нейрохимическая регуляция с участием физиологически активных веществ мозга. Поэтому представляется перспективным поиск лекарственных средств, направленных на восстановление поврежденного МК, на основе изучения церебровас-кулярной активности эндогенных соединений мозга.
В нейросекреторных клетках гипоталамуса быка (N. Paraventricularis and N. Supraopticus) A.A. Галояном и его сотрудниками были обнаружены полипептиды, обогащенные пролином. Эти пептиды были идентифицированы и в нейросекреторных гранулах нейрогипофиза, показан их гормональный характер, расшифрована первичная структура [2, 3]. Оказалось, что они содержат от i0 до i5 аминокислотных остатков, в числе которых 4 остатка пролина. Показано, что эти полипептиды обладают нейропротекторными [4] и иммунотропными [5] свойствами. Один из обогащенных пролином полипептидов (ПБП-i) имеет следующую структуру: Ala- Gly- Ala- Pro -Glu- Pro - Ala-Glu- Pro-Ala-
* Адресат для корреспонденции: 0025 Ереван, ул. Корюна, д. 2, тел. +374 964 7iii7, e-mail: emmayeritsyan@gmail.com.
Gln-Pro-Gly-Val-Tyr [2, 3]. Показано, что ПБП-1 проявляет нейропротекторные свойства и способность предотвращать нейродегенерацию в гиппокампе, вызванную амилоидным пептидом Aß(25—35) [6].
Целью данной работы является исследование действия ПБП-1 на локальный мозговой кровоток (ЛМК) в норме, а также при нарушении кровотока, вызванном перевязкой правой общей сонной артерии (пОСА).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В опытах использовались белые беспородные крысы-самцы массой 180—240 г. Все эксперименты осуществлялись согласно нормативам "The PHS Guide for the Care and Use of Laboratory Animals". Животные находились в условиях лабораторного вивария при контролируемой температуре (25 ± 2°C) и влажности (40—70%). Световой цикл в виварии был стандартным: животных выдерживали 12 ч при освещении и 12 ч в темноте. Доступ к питьевой воде и корму для крыс (Teklad rat chow) был неограничен. Животные акклиматизировались в течение 1 недели до эксперимента.
Хирургическое вмешательство: односторонняя перевязка пОСА. Крыс анестезировали нембута-лом (40 мг/кг, в/б). Перевязку пОСА проводили под общим наркозом по ранее описанной методике [7, 8]. Через срединный разрез шеи открывали доступ к правой сонной артерии, после чего пере-
вязывали ее нейлоновой нитью (Surgical Specialties Co., Reading, PA, USA). Левая общая сонная артерия оставалась нетронутой в течение всего эксперимента.
ЛМК и лазерная допплеровская флоуметрия (ЛДФ). Мониторинг ЛМК в правом полушарии мозга с кровоснабжением от пОСА [9] осуществляли с помощью непрерывной ЛДФ (Transonic Systems Inc. BLF-21 U.S.A). После перевязки пОСА каждую крысу подвергали стереотаксической хирургии (Stoelting, Wood Dale, IL, U.S.A). Разрезы наносили на кожу размером 1.5 см по средней линии и под операционным микроскопом (OP-Microscope, Zeiss, Wetzler, Germany), открывали черепное отверстие (4.5 х 6 мм) в правом части лоб-но-теменной области (2 мм поперечно и 1 мм каудально от брегмы) с помощью скоростной бормашины. Во время трепанации черепа наконечник бора непрерывно охлаждался физиологическим раствором во избежание термического повреждения коры мозга крыс. Твердая мозговая оболочка оставалась незатронутой, правая лобно-теменная кора была открыта. Изменения ЛМК определяли с помощью ЛДФ, что является хорошо разработанным методом для измерения ЛМК [10]. Зонд ЛДФ фиксировали микроманипулятором так, чтобы минимизировать движения датчика, избегая установления его прямо над крупными кровеносными сосудами. Зонд закрепляли так, чтобы, касаясь оболочки, он не вызывал давления и не приводил к окклюзии сосудов и к снижению перфузии в соответствующей области. При закреплении датчика в определенном положении поддерживается правильная техника мониторинга, что позволяет измерять изменения кровотока в исследуемой ткани. Стационарные базовые значения ЛМК записывались до фиксации лигатуры пОСА так, чтобы все данные ЛМК были выражены в процентах от соответствующих основных значений. ЛМК контролировали непрерывно в течение окклюзии пОСА около 20 минут после в/б введения препарата (90 минут). Мониторинг ЛМК длился 3 часа.
Измерение артериального давления. Систолическое артериальное давление (САД) и диастоличе-ское артериальное давление (ДАД) крыс измеряли в хвостовой артерии с помощью метода "tail-cuff', рекомендованного Американской ассоциацией кардиологов [11]. Этот метод (LE5001; Letica, Hos-pitalet, Barcelona, Spain) отличается от других высокой чувствительностью импульсивного датчика в сочетании с точной программой микропроцессора, что позволяет выявлять различия между САД и ДАД, а также измерять среднее давление крови (СД) и частоту сердечных сокращений (ЧСС). В течение 60 мин артериальное давление и сердечные сокращения непрерывно записывали в нормальных условиях и после в/б введения препарата. Измерения проводили между 13.00 и 15.00 ч во избежание влияния циркадного цикла. Чтобы вы-
Рис. 1. Действие в/б введения ПБП-1 на локальный мозговой кровоток. Показано значение кровотока, среднее ± стандартное отклонение (p < 0.01).
явить пульсацию хвостовой артерии крыс предварительно обогревали в камере при 35°C в течение 10 минут, после чего их помещали в пластмассовый футляр [12]. Регуляция температуры тела крыс в диапазоне 27—30°C осуществляется с помощью хвоста, поэтому при нагревании футляра сосуды хвоста оставались расширенными. При достаточном прогревании для увеличения пульсового кровенаполнения до 25% от максимально допустимого ошибки были сведены к минимуму [7]. Манжет с пневматическим датчиком импульсов был прикреплен к хвосту крыс, после чего были зафиксированы СД и ЧСС. До начала эксперимента в течение 7 дней крыс приучали к этой процедуре. Эксперименты проводились ежедневно в течение 5 дней.
Статистический анализ. Все данные представлены в виде средних и стандартных отклонений. Статистический анализ проведен с помощью программы Microsoft Excel 2007. Множественные сравнения выполнены по i-критерию Стьюдента. Различия считались статистически достоверными при p < 0.01.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Из результатов, приведенных на рис. 1, следует, что введение ПБП-1 (4 мкг/крысу) контрольным животным приводит к увеличению ЛМК. Исходные значения ЛМК, полученные с помощью ЛДФ, были приняты за 100%. Действие ПБП-1 проявилось через 40 мин после в/б введения препарата. Максимальная эффективность ПБП-1 была выявлена через 2 ч: ЛМК превысил контрольный уровень примерно на 23.5 ± 2.6% (p < 0.01). ПБП-1 в меньших (1 мкг/крысу) и в больших (8 мкг/крысу) дозах не вызывал значимых изменений МК.
Следует отметить, что эффекты ПБП-1 более выражены в условиях цереброваскулярных нарушений. Так, окклюзия пОСА приводит к снижению уровня кровотока примерно на 36 ± 1.5% (p < 0.01)
202
БАЛАСАНЯН и др.
Рис. 2. Действие в/б введения ПБП-1 в дозах 1, 4 и 8 мкг/крысу на локальный мозговой кровоток после окклюзии правой общей сонной артерии. Показано значение кровотока, среднее ± стандартное отклонение (р < 0.01).
по сравнению с базальным уровнем. Введение ПБП-1 в зависимости от дозы приводит к различным изменениям кровоснабжения (рис. 2). Фармакологический эффект ПБП-1 более выражен в дозе 4 мкг/крысу. Через 20 мин после введения ПБП-1 кровоснабжение мозга усиливается, однако отмеченные сдвиги носят статистически недостоверный характер. Через 40 мин после введения ПБП-1 наблюдается достоверное улучшение ЛМК на 33.5 ± 1.8% (р < 0.01), которое достигает своего максимального уровня к 90-й мин. Препарат способен увеличивать кровоснабжение мозга на 46.5 ± ± 3.1% (р < 0.01), что превышает базальный уровень. Результаты сведены в таблицу. Один из экспериментов продемонстрирован на рис. 3.
При введении ПБП-1 в дозе 1 и 8 мкг/крысу отмечено некоторое улучшение МК. Более того, в данных условиях было зарегистрировано сокращение продолжительности действия препарата. Та-
ким образом, после введения ПБП-1 в дозе 1 мкг/крысу на 90-й мин уровень ЛМК возрастал на 12.1 ± 1.9% (p > 0.01) и оставался неизменным в течение более 2 часов. Максимальное увеличение МК после введении ПБП-1 в дозе 8 мкг/крысу составляло 19.1 ± 3.5% (p > 0.01), что было зарегистрировано на 80 мин и оставалось неизменным до конца эксперимента.
Влияние ПБП-1 на артериальное давление показано на рис. 4, демонстрирующем, что введение ПБП-1
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.