УСПЕХИ СОВРЕМЕННОЙ БИОЛОГИИ, 2008, том 128, № 1, с. 3-20
УДК 579.25.082.261:582.232
ЦИАНОБАКТЕРИИ: ПЕРСПЕКТИВНЫЕ ОБЪЕКТЫ НАУЧНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ И БИОТЕХНОЛОГИИ
© 2008 г. О. А. Кокшарова
Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. АН. Белозерского, Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва
Дан обзор методов геномики и протеомики для исследования цианобактерий, оксигенных фотоав-тотрофных бактерий, широко используемых для изучения таких процессов, как фотосинтез и его регуляция, клеточное деление и дифференцировка, азотфиксация, метаболизм углерода, азота и водорода; устойчивость к различным стрессовым факторам, эволюция. Отмечено, что наличие разнообразных генетических инструментов и доступность информации о нуклеотидных последовательностях геномов цианобактерий позволяют: 1) наблюдать за изменениями генной экспрессии на уровне транскрипции в ответ на изменения условий окружающей среды сразу по всему геному или по большим группам генов; 2) изучать с помощью методов протеомики регуляцию различных биологических процессов на белковом уровне; 3) идентифицировать, изучать, модифицировать и сравнивать ци-анобактериальные гены; 4) анализировать эволюционные взаимосвязи, в том числе эволюционные связи между цианобактериями и хлоропластами. Наличие разработанных методов молекулярной генетики цианобактерий позволяет шире использовать разнообразные биосинтетические возможности этих фотоавтотрофных организмов в биотехнологии.
ВВЕДЕНИЕ
Цианобактерии являются древнейшими организмами, осуществляющими фотосинтез с выделением молекулярного кислорода. Небольшое количество клеток некоторых цианобактерий способно дифференцироваться в специализированные клетки, гетероцисты, в которых происходит фиксация азота. Понимание потенциальных возможностей цианобактерий расширяется при наличии разработанных генетических методов и данных о геномных нуклеотидных последовательностях. Цианобактерии интенсивно используются как модельные организмы для изучения фундаментальных биологических процессов, в их числе: фотосинтез и его генетический контроль [2, 6, 19, 20, 199, 238]; фоторегуляция генной экспрессии [149]; клеточная дифференцировка и фиксация азота [244]; метаболизм азота, углерода и водорода [8, 10, 11, 126, 143, 236]; устойчивость к стрессовым факторам окружающей среды [1, 14, 145, 240]; биологические часовые механизмы в клетке [128, 135, 144], клеточное деление [73, 132], молекулярная эволюция [130, 179, 210]. Наличие эффективных генетических методов позволило использовать цианобактерии в биотехнологии для производства специфических продуктов, для биодеградации органических загрязнений и для многих других целей.
Недавний обзор генетических подходов, используемых для изучения цианобактерий, включил в себя данные о секвенировании геномов ряда цианобактерий и некоторые примеры их биотехнологического использования [134].
Данный обзор ставит своей целью дать представление о генетических методах исследования цианобактерий, используемых для решения фундаментальных биологических проблем и прикладных биотехнологических задач.
ЦИАНОБАКТЕРИИ В БИОСФЕРЕ
Цианобактерии - древняя группа живых организмов, роль которой в эволюции и существовании биосферы нашей планеты особенно значительна [4]. В ботанической литературе их до сих пор иногда называют синезелеными водорослями, где они рассматриваются как таксон высокого ранга - отдел или тип в системе низших растений.
Цианобактерии по характеру своей клеточной организации соответствуют грамотрицательным бактериям и представляют их самостоятельную эволюционную ветвь. Цианобактерии - это фо-тотрофные микроорганизмы, которые осуществляют фотосинтез с выделением кислорода. Морфологическое разнообразие описанных видов (более 1500 видов) охватывает широкий спектр форм - от одиночных клеток и простых трихомов до многорядных трихомов с истинным ветвлением, содержащих дифференцированные клетки [15]. Колонии цианобактерий, образованные нитчатыми формами, могут иметь макроскопические размеры. Отдельные клетки цианобактерий способны ползать по плотному субстрату.
Клетка цианобактерий - типичная прокарио-тическая клетка. Ядро и клеточные органеллы
отсутствуют. Фотосинтетический аппарат представлен тилакоидами - сдвоенными мембранами. Их количество и характер их расположения различен у разных видов цианобактерий. На поверхности тилакоидов находятся фикобилисомы -структуры, улавливающие фотоны света и передающие их реакционным центрам фотосинтетического аппарата. Сине-зеленый цвет цианобактерий обусловлен наличием пигментов - зеленого пигмента, хлорофилла "а", и синего пигмента, фикоцианина, у некоторых видов имеется еще красный пигмент, фикоэритрин.
Клетка цианобактерий содержит также карбоксисомы - полиэдральные тела, которые образованы молекулами ключевого фермента фотосинтеза - рибулозодифосфаткарбоксилазы. Эти карбоксисомы служат для увеличения концентрации С02 вблизи главного фермента цикла Кальвина. Цианобактерии обладают углерод-концентрирующим механизмом, который и позволяет им создавать большие концентрации углерода в клетке [126]. У цианобактерий, живущих среди планктона, присутствуют газовые везикулы, которые содержат газ и придают клеткам лучшую плавучесть.
Некоторые цианобактерии способны к клеточной дифференцировке. Одним типом специализированных клеток являются акинеты (или споры) - это крупные покоящиеся клетки с утолщенной оболочкой. Они служат для выживания организма в неблагоприятных условиях. При наступлении оптимальных условий акинеты прорастают. Другим типом дифференцированных клеток являются гетероцисты - специализированные клетки, в которых осуществляется процесс фиксации атмосферного азота. Их могут образовывать некоторые нитчатые цианобактерии (АпаЬаепа, N08100). Способностью к азотфикса-ции обладают лишь некоторые прокариотиче-ские организмы, обеспечивая все живое на Земле биологическими формами азота. Молекулярный азот, присутствующий в огромном количестве в атмосфере, может быть использован живыми организмами благодаря активности ферментного комплекса нитрогеназы. В результате работы этого комплекса происходит восстановление азота до аммиака, который потом включается в состав азотсодержащих органических молекул. Фермент нитрогеназа не активен в присутствии кислорода, поэтому специализированные клетки гетероцисты служат оптимальным местом для анаэробной фиксации азота. Их толстая полиса-харидная капсула, гликолипидный слой, подстилающий ее изнутри клетки, препятствуют проникновению молекул кислорода извне.
Отсутствие активности фотосистемы 2 и повышенная активность дыхательных ферментов в гетероцистах усиливают защиту нитрогеназы от
кислорода. Образующиеся соединения связанного азота поступают в соседние вегетативные клетки через микроплазмодесмы, а от них в гетероцисты поступает органический субстрат, необходимый для фиксации азота. Цианобактерии представляют собой единственный пример про-кариотического многоклеточного организма, у которого происходит функциональная специализация клеток. Другим приспособлением для защиты нитрогеназы от инактивации ее кислородом служит способность некоторых видов осуществлять фиксацию азота при отсутствии фотосинтеза, в ночное время, или посредством чередования фотосинтеза и азотфиксации, подчиняясь определенному эндогенному ритму. Так происходит азотфиксация у морской планктонной цианобактерии Trichodesmium [36]. Массы этой цианобактерии населяют теплые моря и океаны, поэтому фиксация азота этим организмом имеет огромное значение для жизни океана.
ЦИАНОБАКТЕРИИ -ОБЪЕКТЫ ГЕНЕТИКИ
Генетический перенос у цианобактерий
Чтобы начать любые манипуляции с генами, нужно иметь возможность осуществить генетический перенос молекулы ДНК в клетку изучаемого организма. Генетический перенос может быть осуществлен в результате естественных способов передачи ДНК: трансформации, коньюгации и трансдукции. Для цианобактерий к настоящему моменту известны и используются в научных исследованиях первые два способа переноса генетического материала.
Генетическая трансформация у цианобактерий была впервые открыта в России, в Московском государственном университете, в лаборатории профессора C.B. Шестакова. Как было показано на кафедре генетики МГУ [106, 200], некоторые цианобактерии способны к естественной трансформации экзогенными молекулами ДНК. B результате этого открытия, по сути, была начата эра изучения цианобактерий с помощью методов молекулярной генетики. Одноклеточная цианобактерия Synechococcus sp. PCC 7942 (ранее называлась Anacystis nidulans R2) - первая цианобактерия, для которой описана генетическая трансформация [200]. Этот штамм активно используется при изучении циркадных ритмов [102], углеродного метаболизма цианобактерий [126], механизмов клеточного деления [73, 132]. Затем трансформация была описана для штамма одноклеточной цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803 [106], способного расти в темноте на глюкозе [26, 183]. Этот штамм сыграл главную роль в изучении цианобактериального фотосинтеза. Трансформация описана и для одноклеточ-
ной цианобактерии А§шепе11иш диаёгирИсаШш штамм РЯ-6, также известной как ЗупесИососсш 8р. РСС 7002 [215].
Трансформацию можно эффективно провести, используя отдельные кусочки геля из легкоплавкой агарозы, содержащие фрагменты ДНК дикого типа [75]. Эти кусочки агарозы могут быть расплавлены и раскапаны на газон клеток мутанта непосредственно на чашке Петри. В сочетании с известной последовательностью ДНК генома ЗупесИосувйз ер. РСС 6803 этот способ трансформации позволяет быстро идентифицировать специфичный рестрикционный фрагмент ДНК, комплементирующий мутацию [137, 238].
Почему трансформация возможна только у некоторых одноклеточных цианобактерий, но не у других? Одной из причин может быть наличие в клетках нетрансформируемых цианобактерий экстраклеточных нуклеаз, которые часто встречаются, например, у нитчатых, образующих гете-роцисты цианобактерий [248]. Такие ферменты расщепляют вносимую ДНК. Молекулярные механизмы, лежащие в основе естественной генетической трансф
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.