НЕЙРОХИМИЯ, 2011, том 28, № 1, с. 30-41
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 597.5:591.88
ЦИСТАТИОНИН ß-СИНТАЗА В ЦНС СИМЫ Oncorhynchus masou (SALMONIDAE) И КАРПА Cyprinus carpió (CYPRINIDAE)
© 2011 г. Е. В. Пущина1, *, А. А. Вараксин Д. К. Обухов 2
Институт биологии моря им. А.В. Жирмунского ДВО РАН, Владивосток 2Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург
Иммуногистохимическим маркированием показано наличие цистатионин ß-синтазы в нейронах вентральной спинномозговой колонны, продолговатого мозга, клетках и волокнах мозжечка, оптического тектума и конечного мозга симы Oncorhynchus masou и карпа Cyprinus carpió. Выявлены значительные межвидовые различия в локализации и уровне оптической плотности иммунореактив-ных структур в исследованных отделах мозга симы и карпа, связанные, очевидно, с особенностями питания и поведения этих рыб. У карпа в продолговатом и спинном мозге идентифицированы интенсивно маркированные сосуды, которые не были найдены у симы. В перивентрикулярной области продолговатого мозга, вентральной и латеральной зонах мозжечка карпа выявлены высоко CBS-иммуногенные клетки, лишенные отростков. Размеры клеток и их местоположение в мозге и взаимоотношение с Н2$-продуцирующими нейронами указывают на наличие Н2$-продуцирующей глии в перивентрикулярной зоне мозга карпа.
Ключевые слова: цистатионин р-синтаза, сероводород, костистые рыбы, лососевые, карпообразные, постнатальный нейрогенез, сосудистая регуляция, газообразный нейротрансмиттер.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
CBS — цистатионин ß-синтаза, CBS-ир — цистатионин ß-синтаза иммунореактивные клетки, CSE — цистатионин у-лиаза, Вв, Вд, Вл — вентральное, дорсальное и латеральное клеточные скопления вентрального теленцефалона, ВД - вагусная доля, ВСМК — вентральная колонна мотонейронов, ДВП — долговременная потенциация, Дд, Дл, Дц — дорсальное, латеральное и центральное клеточные скопления дорсального теленцефалона, ИГХ маркирование — иммуногистохимическое маркирование, ИФГ — инфраганглионарное сплетение, МПК — межпучковая клетка, МРФ — медиальная ретикулярная формация, НМДА — N-метил-Э-ас-партат, ПВЗ — перивентрикулярная зона мозга, РСК — ретикулоспинальные клетки.
ВВЕДЕНИЕ
Большинство исследований по сероводороду было посвящено его токсическим эффектам, однако недавно H2S стал рассматриваться в качестве физиологически активного посредника [1, 2]. Это было связано с обнаружением высоких эндогенных концентраций сульфидов в крови и тканях мозга млекопитающих и некоторых других позвоночных животных [3—5]. Эндогенно H2S синтезируется из
* Адресат для корреспонденции: 690041 Владивосток, ул. Пальчевского, 17, тел.: (4232) 310-691, е-mail: puschina@mail.ru.
L-цистеина пиридоксаль-5'-фосфат-зависимыми ферментами — цистатионин ß-синтазой (CBS) и цистатионин у—лиазой (CSE), экспрессирующими-ся во многих тканях [6—8]. H2S участвует в расслаблении гладкой мускулатуры у млекопитающих и человека [9, 10], физиологические концентрации этого газа усиливают активность НМДА рецепторов и облегчают индукцию ДВП в гиппокампе [6]. Рыбы — наиболее древние представители позвоночных. Исследование локализации CBS, иммуно-гистохимического маркера H2S в головном мозге костистых рыб ранее не проводилось.
Целью настоящей работы стало сравнительное исследование локализации цистатионин ß-синтазы в ЦНС и сосудах мозга симы Oncorhynchus masou и обыкновенного карпа Cyprinus carpio.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе были использованы 10 особей трехлетней симы Oncorhynchus masou и 10 особей карпа Cyprinus carpio. Животных анестезировали с помощью 0.1%-ного раствора трикаин метан сульфоната (MS-222, Sigma, USA) в течение 10-15 мин. Материал был получен с Рязановского экспериментально-производственного рыбоводного завода в 2008 г.
Иммуногистохимия CBS. Для идентификации H2S-продуцирующих нейронов использовали метод непрямого авидин-биотин-пероксидазного ^BC метод) мечения на свободно плавающих срезах. Мозг животных фиксировали в 4%-ном раство-
ре параформальдегида, приготовленном на 0.1 М фосфатном буферном растворе (рН 7.2), в течение 2 ч при 4°С. Материал промывали в течение 1 сут в 30%-ном растворе сахарозы и готовили на криоста-те поперечные срезы толщиной 50 мкм. Для блокирования активности эндогенной пероксидазы срезы инкубировали в 1%-ном растворе перекиси водорода на 0.1 М фосфатном буфере в течение 30 мин. Затем срезы инкубировали с поликлональ-ными антителами мыши против цистатионин ß-синтазы (Abcam ab54883) в разведении 1 : 5000 при 4°С в течение 1 сут. Далее срезы инкубировали с вторичными биотинилированными антителами лошади против иммуноглобулинов мыши (Vector Labs, Burlingame, USA) в течение 2 ч при комнатной температуре; промывали в трех сменах 0.1 М фосфатного буфера по 5 мин. Иммуногистохимиче-скую реакцию проявляли с помощью стандартной авидин-биотиновой системы визуализации ABC (Vectastain Elite АВС Kit, Vector Labs, Burlingame, USA). Для выявления продуктов реакции срезы инкубировали в субстрате для выявления пероксидазы (VlP Substrate Kit, Vector Labs, Burlingame, USA), контролируя процесс развития синей окраски под микроскопом, срезы промывали и монтировали на предметные стекла, обезвоживали по стандартной методике и заключали в бальзам.
Для оценки специфичности иммуногистохими-ческой реакции использовали метод негативного контроля. Срезы мозга вместо первичных антител инкубировали с 1%-ной неиммунной сывороткой лошади в течение 1 сут и далее проводили как с первичными антителами. Во всех контрольных экспериментах иммунопозитивная реакция отсутствовала.
Для сравнительной характеристики интенсивности маркирования CBS в мозге рыб использовалось измерение оптической плотности продуктов ИГХ маркирования CBS. Измерения оптической плотности проводили на микроскопе Axiovert Apo-tome и обрабатывали с помощью программного обеспечения Adobe PhotoShop 7. Уровень оптической плотности (УОП) в CBS-ир клетках оценивали по следующей шкале: высокий (160—130), средний (130-100), умеренный (100-80), слабый (8050 ЕОП), а ее исходное значение измеряли на контрольных препаратах.
При обработке результатов применяли параметрический метод (í-тест Стьюдента) анализа. Данные обрабатывали при помощи пакетов программ Statis-tica, Excel.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Иммунолокализация CBS в головном мозге симы Oncorhynchus masоu и карпа Cyprinus carpio была выявлена в нейронах вентральной спинномозговой колонны (рис. 1а, б), продолговатого мозга (рис. 1в, д, 2а, б), волокнах и клетках мозжечка (рис. 2в, г),
оптического тектума (рис. 3а, б) и конечного мозга (рис. 2д, е). Морфометрические параметры CBS-ир клеток в исследованных структурах мозга рыб и уровень иммуногистохимической реакции в них представлены в таблице. Во всех областях головного мозга интенсивность маркирования нейронов изменялась от умеренной до высокой. Иммунолока-лизация CBS у симы и карпа имела существенные межвидовые отличия. У карпа в продолговатом и спинном мозге были идентифицированы интенсивно маркированные сосуды (рис. 1б, г, е), которые не были выявлены у симы. Другое отличие было связано с наличием высоко иммуногенных округлых клеток в перивентрикулярной области карпа (рис. 3в, г, е) и их отсутствие в перивентрику-лярной области симы. Морфометрические характеристики CBS-ир клеток и данные об интенсивности ИГХ-маркирования карпа и симы представлены в таблице. На рис. 4 приведены сравнительные гистограммы (а—д) уровня оптической плотности ИГХ-маркирования CBS в различных структурах мозга симы и карпа.
При ИГХ маркировании CBS были идентифицированы тела нейронов и проксимальные участки их дендритов (рис. 1а—в, д, 2а, б), что дало возможность классифицировать CBS-иммунопозитивные нейроны в соответствии с нейрохимической классификацией Аревало [11]. В соответствии с классификацией у рыб были идентифицированы пять клеточных типов: I тип — сверхкрупные мультиполяр-ные клетки с 1—5 первичными дендритами, размером тела от 40 мкм и более; II — крупные и среднего размера клетки с тремя или более дендритами, размер клеточного тела составляет 25—40 мкм; III тип — среднего размера клетки с 1—3 отростками, лишенными варикозных утолщений и размером тела 15—25 мкм; IV тип — мелкие клетки округлой, овальной либо биполярной формы тела размером 6—15 мкм. Клетки, размеры тела у которых не превышали 6 мкм, классифицировались нами как сверхмалые и были отнесены к V типу. Фермент синтеза сероводорода имеет цитоплазматическую локализацию в телах нейронов и проксимальных участках их дендритов (рис. 2а, б). Помимо нейронов иммунолокализация CBS в ЦНС рыб была выявлена в клетках глии (рис. 1в, 2б, 3в—г, е) и волокнах (рис. 1а, в, 2в, г). Маркированные сосуды и капилляры головного мозга в большей степени были представлены у карпа (рис. 1б, г, е, 3d), у симы сосудистая CBS-иммунолокализация была выявлена только в области, окружающей нейросекреторую зону area postrema (рис. 1d).
В спинном мозге у исследованных рыб CBS была выявлена в нейронах ВСМК I и II типов (рис. 1а, б), однако уровень активности этих клеток у симы почти двукратно превышал активность нейронов у карпа (рис. 4д). У симы обнаружены CBS-позитив-ные крупные первичные ВСМК, размеры тел приведены в таблице. Уровень реакции в клетках оце-
Рис. 1. Иммунолокализация цистатионин ß-синтазы в спинном и продолговатом мозге симы Oncorhynchus masou и карпа Cyprinus carpio.
а — CBS-ир нейроны вентральной спинномозговой колонны (квадратом выделены первичные мотонейроны) симы, б — карпа, белыми стрелками обозначены сосуды; в — CBS-ир нейроны продолговатого мозга карпа, в квадрате клетки комиссураль-ного ядра Кахаля, черной стрелкой показана ретикулоспинальная клетка, г — CBS-иммунолокализация в дорсомедиальных канатиках спинного мозга карпа, квадратом ограничены CBS-ир нейроны, д — CBS-ир нейроны и сосуды в области area postrema симы, е — CBS-иммунолокализация в вагусной доле карпа. Обозначения: АП - area postrema, ВД — вагусная доля, ДМК — дорсомедиальный канатик, ПВО — паравентрикулярная область, КВ — комиссуральные волокна, МПП — медиальный продольный пучок, Цк — центральный кан
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.