РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2008, том 48, № 2, с. 160-166
^ РАДИАЦИОННАЯ
ЦИТОГЕНЕТИКА
УДК 575:591.147.1:539.166
ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ В ФОЛЛИКУЛЯРНОМ ЭПИТЕЛИИ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ КРЫС ПРИ ДЛИТЕЛЬНОМ ВОЗДЕЙСТВИИ
Y-ИЗЛУЧЕНИЯ в малых дозах
© 2008 г. О. В. Ермакова1*, А. В. Павлов2, Т. В. Кораблева2
1 Институт биологии Коми НЦ Уральского отделения РАН, Сыктывкар 2 Ярославская государственная медицинская академия, Ярославль
Исследовано влияние длительного воздействия низкоинтенсивного у-излучения в дозах 5 и 50 сГр (мощность дозы - 25 и 400 мкГр/ч, продолжительность облучения - 55 и 80 сут) на процессы формирования фолликулярных тироцитов с микроядрами в щитовидной железе крыс репродуктивного возраста линии Вистар. Хроническое воздействие низкоинтенсивного у-излучения в обеих использованных дозах вызывает 3-кратное увеличение частоты микронуклеированных тироцитов. В связи с отчетливым преобладанием в опыте размерных классов мелких микроядер их средние площади оказались в 1.4-2 раза меньше, чем у контрольных животных. Данный феномен может быть воспроизведен в модельных экспериментах по однократному облучению гемитироидэктомированных животных в дозах 2-4 Гр. Полученные результаты свидетельствуют о высокой информативности микроядерного теста для раннего выявления лучевых поражений генетического аппарата фолликулярного эпителия щитовидной железы.
Крысы, щитовидная железа, тироциты, у-излучение, низкие мощности доз, микроядра, генетические повреждения.
Одним из информативных и быстрых способов индикации цитогенетических повреждений является микроядерный тест, основанный на подсчете количества постмитотических интерфазных клеток с добавочными ядерными тельцами -микроядрами, образующимися из ацентрических фрагментов или целых хромосом в результате кластогенного и анеугенного воздействий гено-токсических агентов разной природы [1, 2].
В качестве клеточных систем для постановки микроядерного теста наиболее часто используются обновляющиеся популяции (гемопоэтиче-ские клетки, клетки семенников, покровные эпителии), характеризущиеся высокой интенсивностью клеточного деления (здесь и далее использована классификация C.P. Leblond [3]). Подсчет частоты микронуклеированных эритроид-ных клеток в красном костном мозге грызунов входит в число стандартных краткосрочных тестов на генотоксичность in vivo [4, 5]. Широкое распространение получило изучение образования микроядер в культуре стимулированных к бласт-трансформации лимфоцитов периферической крови в сочетании с дополнительной обработкой цитохалазином В [6].
* Адресат для корреспонденции: Республика Коми, 167982 Сыктывкар, ул. Коммунистическая, 28, Институт биологии Коми НЦ УрО РАН; тел.: (2212) 43-04-78; e-mail: erma-kova@ib.komisc.ru.
Имеющиеся данные об индукции микроядер ионизирующим излучением в малых дозах в таких клеточных популяциях весьма противоречивы. Экспериментальные данные, полученные в последние годы, свидетельствуют о нелинейном характере зависимости доза-эффект: в диапазоне доз ниже 0.3 Гр показана высокая радиочувствительность клеток ("гиперчувствительность"), при более высоких дозах (0.5-1.0 Гр) - повышение радиорезистентности на единицу дозы ("индуци-бельная радиорезистентность") [7-9]. Этот феномен связывают с индукцией процессов репарации ДНК при достижении определенного порога повреждения клеток [10, 11].
При исследовании культур лимфоцитов человека в области доз до 50 сГр обнаружено отчетливое увеличение частоты микроядер по сравнению с контрольным уровнем, коррелирующее с дозой облучения. В зависимости от вида излучения некоторые авторы описывают его как линейное или линейно-квадратичное [12-14], причем в диапазоне доз 5-10 сГр кривая доза-эффект имеет плато [14]. Аналогичное плато обнаружено и в диапазоне 25-50 сГр [15], что соответствует данным ряда авторов по частоте аберраций хромосом в том же интервале доз [16, 17]. При воздействии у-излучения в дозах 5-200 сГр (47 сГр/мин) на фибробласты китайского хомячка выявлен ступенчатый характер дозовой зависимости выхода клеток с микроядрами: линейный участок
кривой доза-эффект в области 5-50 сГр переходит в плато, а затем снова наблюдается линейный участок, но уже с другим наклоном [18]. При исследовании частоты клеток с микроядрами в нескольких поколениях клеток HeLa при остром и пролонгированном облучении в дозах 10-40 сГр обнаружено, что она не изменяется после острого облучения, но сохраняется повышенной на протяжении трех поколений после пролонгированного облучения в лабораторных условиях и при нахождении в зоне аварии на ЧАЭС [19].
Только в растущих (гепатоциты, эпителий почек, эндокринных и экзокринных желез) и стабильных (кардиомиоциты, нейроны) популяциях клетки существуют в ткани на протяжении достаточно продолжительного времени и, следовательно, способны сохранять и накапливать структурные изменения ДНК, связанные со старением или с влиянием внешних повреждающих факторов. Поэтому все чаще в качестве клеточных систем биоиндикации генотоксических повреждений с помощью микроядерного теста изучаются популяции с исходным низким уровнем пролифе-ративной активности, предварительно стимулированные к делению; наиболее подробно в этом плане исследованы гепатоциты [20, 21].
Не менее перспективной, но гораздо менее изученной клеточной тест-системой является фолликулярный эпителий щитовидной железы (ЩЖ): многие техногенные факторы (мутагены, радионуклиды и др.) способны индуцировать развитие патологических изменений органа, сопровождающихся усилением пролиферации и повреждением генома железистых клеток [22, 23]. Ранее показано, что микроядерный тест на модели предварительно стимулированных к размножению фолликулярных тироцитов в опытах in vivo является чувствительным методом оценки интенсивности влияния метилнитрозомочевины на ти-реоидную паренхиму. При этом удается зарегистрировать кумулятивный эффект субпороговых доз мутагена [24].
В литературе имеются единичные описания феномена усиленного образования микроядер в культуре тироцитов крыс под влиянием радиационных воздействий: в диапазоне доз 2-14 Гр частота хромосомных аберраций линейно нарастает со скоростью 1.4%/Гр при у-излучении и 2.4%/Гр при облучении протонами [25, 26]. Однако данные о возможности использования метода цитогенетического анализа микроядер для биоиндикации эффекта на тиреоидном эпителии при воздействии хронического низкоинтенсивного у-излучения на организм в опытах in vivo в литературе отсутствуют. Изучению этого вопроса и посвящено настоящее исследование.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
Эксперименты выполнены на 41 крысе (самцы) линии Вистар массой 200-250 г. Для взятия материала ЩЖ животных умерщвляли передозировкой паров эфира. Поставлено две серии опытов.
а) Хроническое у-облучение. Опыты выполнены на 24 животных, разделенных на три равные группы: контроль, опыт-1 и опыт-2. В обеих опытных группах общее у-облучение животных проводили в "домике хронического облучения", источником у-излучения были две ампулы со стальной оболочкой, содержащие 0.474 х 106 и 0.451 х 106 кБк 226Ra, разнесенные на расстояние 2.5 м. Дозовая нагрузка на организм животных определялась мощностью экспозиционной дозы (измерения проводили радиометром ДРГЗ-01Т1) и сроками содержания в условиях облучения. Крысы находились в зоне воздействия ионизирующего излучения круглосуточно с перерывами на кормление и уборку помещения. Суммарную поглощенную дозу облучения определяли по показаниям термолюминесцентного дозиметра (ДТУ), которые используются в составе ТЛД-систем с ручной загрузкой детекторов в тракт считывания дозиметрического измерителя ДВГ-02ТМ (Россия).
В группе опыт-1 суммарная поглощенная доза облучения была минимальной и составила 5 Гр за 80 сут облучения (мощность 20-25 мкГр/ч), в группе опыт-2 - 50 сГр за 55 сут (мощность дозы 400 мкГр/ч). В обеих группах эксперименты начинались одновременно, крыс забивали через 15 нед после начала опытов.
б) Острое j-облучение. С целью оценки влияния кластогенного эффекта ионизирующего облучения [27] дополнительно проводили эксперименты по морфологическому и морфометрическому анализу микроядер на модели предварительно стимулированных к размножению фолликулярных тироцитов при действии на организм крыс острого у-облучения (установка "Рокус М", с 60Со-источником, мощность дозы 1.847 сГр/с, поле облучения 24 х 24 см). В качестве стандартной модели индукции пролиферации тироцитов использовали левостороннюю гемитироидэктомию [28]. Операции проводили под общим гексенало-вым наркозом, крыс забивали на 10-е сут эксперимента. 17 оперированных крыс были подвергнуты однократному у-облучению всего организма через 48 ч после операции в дозах 0.5; 1.0; 2.0 и 4.0 Гр (на каждую дозу изучено по 4-5 животных).
Свежие фрагменты ткани ЩЖ помещались в термостат и подвергались ферментативной обработке в 0.25%-ном растворе коллагеназы (тип XI, активность 1.205 ед/мг, фирма-производитель -"Sigma", США) в течение 1-2.5 ч при 37°С [29]. Из полученной суспензии клеток изготовляли мазки, которые после подсушивания фиксировали в
Рис. 1. Тироциты с микроядрами (стрелки). а, б - интактные животные, в, г - острое у-облучение (4 Гр); д - хроническое облучение (0.05 Гр); е - хроническое облучение (0.5 Гр). Мазок изолированных клеток. Фикс. этанолом, окр. по Фельгену с подкраской нафтоловым желтым. Об. 90, ок. 7.
96%-ном этаноле и окрашивали на ДНК по Фельгену с подкраской цитоплазмы нафтоловым желтым. Частоту (в %) тироцитов c микроядрами определяли на основании подсчета 1-2 тыс. клеток у каждого животного.
Захват изображений производили с помощью цифрового программно-аппаратного комплекса для визуализации и документирования изображений микроскопа МИКМЕД-2-1600-3т (Россия) с использованием масляного иммерсионного объектива х90. Измерения средней площади микроскопических объектов проводили с помощью программы компьютерного анализа изображений UTSCSA Image Tool for Windows (version 3.0). В каждой аберрантной клетке отдельно измеряли микроядра и основное ядро.
Полученные количественные результаты обрабатывали с помощью пакетов прикла
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.