ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2007, том 54, № 1, с. 31-38
УДК 581.1
ЦИТОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ АКТИВНОСТИ ПРОТЕАЗ И рН ВАКУОЛИ В КОРНЕВЫХ КЛУБЕНЬКАХ Medicago truncatula
© 2007 г. Е. Э. Федорова*, С. Браун**
*Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, Москва **Institute Federatif de Recherche, Gif-sur-Yvette, France Поступила в редакцию 26.09.2005 г.
Формирование вакуолей в инфицированных клетках клубенька люцерны (Medicago truncatula L.) исследовали методами световой и электронной микроскопии. Гистохимическими методами изучали активность протеаз. Для определения активности протеаз использовали флуорогенные субстраты протео-литических ферментов: 7-амино-4-метилкумарин, CBZ-L-фенилаланил-L-аргинин амида гидрохлорид и родамин 110, •uс-(CBZ-L-фенилаланил-L-аргинин амида) дигидрохлорид. Кислотность центральной вакуоли в инфицированных и неинфицированных клетках анализировали с помощью ацидо-тропного красителя нейтрального красного. Показано, что вакуоли имели высокую протеолитиче-скую активность и кислотность в неинфицированных клетках клубенька и молодых инфицированных клетках. Протеолитическая активность зрелых инфицированных клеток с обоими субстратами в зоне активной азотфиксации была низкой.
Medicago truncatula - симбиоз - корневой клубенек - вакуоль - протеазы - нейтральный красный
ВВЕДЕНИЕ
Протеолитические ферменты играют важную роль в процессах развития и старения клеток растения. Благодаря катаболизму белков и реутилизации аминокислот, содержание белка в растительной клетке изменяется в зависимости от стадии онтогенеза и условий окружающей среды [1-3].
Корневые клубеньки образуются на корнях бобовых после инфицирования бактериями рода Rhizobium, что позволяет бобовым растениям фиксировать азот воздуха. Активность протеоли-тических ферментов корневого клубенька бобовых изменяется в зависимости от условий окружающей среды, а также фазы онтогенеза бобового растения [4]. Было показано, что протеолитические ферменты растения-хозяина участвуют в процессах старения корневых клубеньков люцерны [5], сои [6], фасоли [7]. Согласно данным Pladys и Rigaud [7], в стареющих корневых клубеньках бобов деградация леггемоглобина и бактероидов
Сокращения: CBZ - бензилдезоксикарбонил; AMC - 7-ами-но-4-метилкумарин, CBZ-L-фенилаланил-L-аргинин амида гидрохлорид; RPA - родамин 110, •uс-(CBZ-L-фенилаланил-L-аргинин амида) дигидрохлорид.
Адрес для корреспонденции: Елена Эриковна Федорова. 127276 Москва Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений РАН. Электронная почта: elenafedorova06@e-mails.ru
* По требованию читателей цветной рис. 2 может быть полу-
чен от автора Е.Э. Федоровой.
осуществлялась за счет активации цистеиновой протеазы. Неэффективные клубеньки, образуемые на корнях мутантных по гену in1 растений Medicago sativa сорта Saranac, отличались высоким уровнем активности кислых протеаз, который в несколько раз превышал активность в клубеньках растений дикого типа [8]. Экспрессия гена PsCyp15a, кодирующего вакуолярную цистеино-вую протеазу, была отмечена в корневых клубеньках Vicia hirsuta и Pisum sativum [9, 10]. Специфичная для клубеньков цистеиновая протеаза была идентифицирована в актиноризных клубеньках Alnus glutinosa [11]. В инфицированных клетках A. glutinosa до начала активной азотфиксации было отмечено также высокое содержание гена ag12, кодирующего сериновую протеазу [12]. Одним из механизмов регуляции активности ли-тических ферментов в корневых клубеньках может также быть экспрессия специфических ингибиторов протеаз. В клубеньках Vigna unguiculata ингибитор протеаз с мол. м. 21 кД был найден в стареющих инфицированных клетках клубенька, в деградировавших бактероидах, перибактероид-ной мембране, вакуоли [13]. В клубеньках Sesba-nia rotsrata было отмечено повышенное содержание ингибитора сериновых протеаз [14]. В большинстве работ, посвященных исследованию корневых клубеньков, активность протеаз измеряли в экстрактах из целых клубеньков, и нет данных по компартментации активности ферментов. Хотя в работе Vincent и Brewin [15] методами иммуноцитохимии было показано, что цистеино-
вая протеаза локализована в цитоплазматических везикулах, перибактероидном пространстве и вакуолях, активность ферментов in situ не исследовалась.
С целью уточнения роли протеолитических ферментов в процессе симбиоза в предлагаемой работе методами гистохимии было проведено исследование активности протеаз в корневых клубеньках люцерны.
МЕТОДИКА
Растения люцерны (Medicago truncatula L.) выращивали в условиях аэрогидропонной культуры, семена инокулировали штаммом Sinorhizobium meliloti 2011.
Для гистохимического исследования использовали флуоресцентные субстраты протеаз: родамин 110, •wc-(CBZ-L-фенилаланил-L-аргинин амида) ди-гидрохлорид (RPA) и 7-амино-4-метилкумарин, CBZ-L-фенилаланил-L-аргинин амида гидрохлорид (AMC) "Molecular Probes", США). 1 мМ маточный раствор для AMC и 0.1 мМ для RPA в диме-тилсульфоксиде хранили при 20°С.
Для всех анализов клубеньки заливали в 7%-ную агарозу. Срезы толщиной 50-100 мкм получали с помощью вибротома Microcut H1200 ("BIO-RAD", США). Срезы промывали в фосфатном буфере с 0.9%-ным NaCl рН 7.4 (буфер PBS) и помещали в растворы 10 мкМ RPA или AMC на 3 ч. Затем срезы промывали в PBS, помещали на предметные стекла в растворе Citifluor AF1 ("Agar Scientific", США) и просматривали в эпифлуоресцентном микроскопе Reichert Polyvar ("Reichert", Австрия) с блоком фильтров B4 (длина волны возбуждения 475-495 нм, эмиссии 520-560 нм) при использовании пробы RPA, или V1 (возбуждение 400-410 нм, эмиссия >420 нм) для пробы AMC. Срезы также просматривали с использованием конфокального микроскопа Sarastro 2000 ("Molecular Dynamics", США) с аргоновым лазером 514 нм при напряжении 10 мВ.
Ацидотропное окрашивание нейтральным красным выполняли, согласно методу Guttenberg, модифицированному для клубеньков [16]. Срезы толщиной 30-100 мкм были перенесены в раствор 0.001%-ного нейтрального красного в буфере PBS. После 1 ч инкубации срезы промывали в том же буфере, помещали на предметные стекла и фотографировали. Затем покровное стекло удаляли и добавляли 400 мкл смеси ионофоров 20 мкМ карбонилцианид-ж-хлорофенилгидразона (CCCP) и 1 мкМ валиномицина в том же буфере с добавлением 100 мМ KCl. Препараты просматривали через 10 мин и оставляли в растворе на 3 ч.
Для биохимического анализа клубеньки разрезали на три части: апикальную, среднюю и ба-зальную, и размалывали в буфере, содержащем
0.025 M Трис-HCl (pH 7.4), 0.1 M ЭДТА. Уровень протеолитической активности измеряли на флуоресцентном спектрофотометре FluoroscanlI ("Labsystems", Финляндия) с соответствующими фильтрами для RPA (возбуждение 485 нм, эмиссия 538 нм) и AMC (возбуждение 355 нм, эмиссия 460 нм) на микроплатах Costar.
Для цитологического исследования клубеньки люцерны фиксировали в смеси 4%-ного парафор-мальдегида и 3%-ного глутарового альдегида в 50 мМ фосфатном буфере и постфиксировали 1%-ным OsO4. Срезы готовили на ультратоме LKB (Швеция), контрастировали ацетатом урана и лимоннокислым свинцом, согласно стандартным методикам. Срезы просматривали в электронном микроскопе Philips EM208 ("Philips", Нидерланды).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Формирование вакуолей в клетках корневых клубеньков
В центральной части цилиндрического клубенька можно выделить пять зон: апикальная меристема (М), зона инфицирования (II), интерзона Il/III, зона активной азотфиксации (III) и зона старения (IV) [17] (рис. 1a). Меристема, расположенная в апикальной части клубенька, сохраняет свою активность в течение нескольких недель. В зоне II происходит освобождение бактерий из инфекционных нитей и их количество в цитоплазме инфицированных клеток вследствие деления значительно увеличивается. В зоне III дифференцированные бактероиды приобретают способность к азотфиксации. Инфицированные клетки зоны III по сравнению с неинфицированными отличаются значительными размерами и практически полностью заполнены бактероидами.
Клетки корневого клубенька в зависимости от стадии развития и тканевой специфичности содержат вакуоли различных размеров. В клетках меристемы присутствуют многочисленные про-вакуоли и небольшие вакуоли (рис. 1 а-в). В клетках зоны инфицирования (II) вакуолярные ком-партменты увеличиваются в размерах и образуют кольцо вокруг ядра (рис. 16). В интерзоне II/III в неинфицированных клетках происходит образование центральной вакуоли вследствие слияния небольших превакуолей (рис. 1д, 1е). При этом в отличие от неинфицированных клеток в интерзоне II/III вакуоли инфицированных клеток сильно уменьшаются в размерах и практически исчезают (рис. 1в). В этой части клубенька также наблюдали слияние вакуолей с симбиосомами, при этом перибактероидная мембрана объединялась с то-нопластом (рис. 1е). Бактероиды, которые вследствие этого оказались внутри вакуолярной полости, подвергались лизису (рис. 1ж). В зоне актив-
Рис. 1. Морфология клеток и развитие вакуоли в клубеньках Medicago truncatula по данным световой (а-в, з, и) и электронной микроскопии (г-ж).
а - продольный срез 21-дневного клубенька люцерны. Зоны клубенька: М - меристема, II - зона инфицирования, III -зона активной азотфиксации, IV - зона старения; б - вакуоли в различных зонах клубенька. Наименьший объем ваку-олярного компартмента отмечен в интерзоне II/III в сравнении с неинфицированными клетками и зрелыми инфицированными клетками зоны III; в - инфицированная и неинфицированная клетки зоны II. Вакуоли инфицированных клеток содержат включения в сравнении с полностью прозрачным люменом вакуолей неинфицированных клеток; г -базальная часть клубенька, старые, деградировавшие инфекционные клетки имеют нерегулярную форму вследствие утери тургорного давления; д - формирование центральной вакуоли в неинфицированной клетке. Гомотипическое слияние провакуолей; е - формирование центральной вакуоли, слияние небольших вакуолей с центральным компарт-ментом. Стрелка указывает на мембраны в процессе объединения; ж - формирование вакуоли в инфицированной клетке. Слияние мембраны симбиосомы с тонопластом (двойная стрелка), сл
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.