БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 5, с. 669 — 681
УДК 577.151.63
ЦИТОХРОМ ьи ЗАЩИЩАЕТ БАКТЕРИИ ОТ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО И НИТРОЗИЛИРУЮЩЕГО СТРЕССА: ПОТЕНЦИАЛЬНАЯ МИШЕНЬ ДЛЯ АНТИМИКРОБНЫХ ПРЕПАРАТОВ НОВОГО ПОКОЛЕНИЯ
Обзор
© 2015 В.Б. Борисов1*, Е. Форте2, С.А. Силецкий1, М. Арезе2, А.И. Давлетшин1,3, П. Сарти2,4, А. Жуффре4
1 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова,
НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, 119991 Москва; факс: +7(495)939-3181, электронная почта: bor@genebee.msu.su
2 Римский университет Ла Сапиенца, Отдел биохимических наук
и Институт Пастера — Фонд Ченчи Болоньетти, Италия, 1-00185Рим
3 Российский государственный гуманитарный университет, Институт восточных культур и античности, 125993 Москва 4 Институт молекулярной биологии и патологии НИС, Италия, 1-00185 Рим
Поступила в редакцию 22.12.14 После доработки 23.01.15
Цитохром bd — терминальная хинол-оксидаза дыхательной цепи бактерий. Этот трехгемовый интегральный мембранный белок генерирует протон-движущую силу с более низкой эффективностью, чем гем-медные оксидазы. Тем не менее в неблагоприятных условиях роста бактерии часто используют в качестве основной терминальной оксидазы цитохром bd вместо гем-медных ферментов. В особенности это относится к некоторым патогенным и условно-патогенным бактериям в ходе колонизации ими клеток хозяина. В этом обзоре суммированы последние данные о вкладе цитохрома bd в устойчивость бактерий к перекиси водорода, оксиду азота и пероксинитриту, вредным соединениям, вырабатывающимся хозяином как часть иммунного ответа на микробные инфекции. Появляется все больше свидетельств в подтверждение гипотезы о том, что оксидазы типа bd способствуют вирулентности бактерий, содействуя выживанию микробов в условиях окислительного и нитрозилирующего стресса. По этим причинам цитохром bd представляет собой белок-мишень для разработки противомикробных препаратов нового поколения.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: окислительный стресс, нитрозилирующий стресс, активные формы кислорода и азота, дыхательная цепь, терминальная оксидаза, бактерии, вирулентность, антимикробные препараты.
ОБЩИЕ СВОЙСТВА
Цитохром bd — хинол:О2 оксидоредуктаза дыхательной цепи прокариот [1—3], которая еще не обнаружена в эукариотических организмах [4]. Фермент катализирует реакцию четырехэлект-ронного восстановления молекулярного кислорода до воды, используя хинолы в качестве до-
Принятые сокращения: ТМФД — М,М,№,№-тетра-метил-п-фенилендиамин; к — наблюдаемая константа скорости; К — кажущаяся константа ингибирования; ОМОО- — пероксинитрит.
* Адресат для корреспонденции.
норов электронов [5, 6]. Энергия, выделяющаяся в этой редокс-реакции, запасается в виде трансмембранной разности электрических потенциалов [7] посредством молекулярного механизма, который до конца не расшифрован. Предполагается, что мембранный потенциал в основном создается за счет векторного перемещения протонов по протонпроводящему пути, идущему из цитоплазмы к активному центру, расположенному на противоположной, периплаз-матической стороне мембраны [8—12]. Установлено, что в отличие от гем-медных оксидаз цитохром bd не функционирует как протонный насос [8—15]. Таким образом, он работает с более
низкой энергетической эффективностью по сравнению с гем-медными дыхательными ферментами. Для цитохрома bd соотношение Н+/е-(число переносимых через мембрану протонов при транспорте одного электрона) равно 1, тогда как для большинства гем-медных оксидаз Н+/е- = 2 [12, 16-19].
Цитохром bd оксидазы обнаруживаются как у безвредных, так и у патогенных бактерий, в числе которых Mycobacterium tuberculosis [20], Klebsiella pneumoniae [21], Shigella flexneri [22], Listeria monocytogenes [23], Streptococcus [24], Brucella [25, 26], Salmonella [27, 28] и представители класса Bacteroides [29]. У этих патогенов отмечена положительная корреляция между вирулентностью и уровнем экспрессии цитохрома bd [30].
Экспрессия цитохрома bd усиливается при неблагоприятных условиях роста, например, при низком давлении кислорода, в присутствии ядов (цианида) [31] или разобщителей (прото-нофор) [32] в окружающей среде, при защелачи-вании среды [31] или высокой температуре [33]. У азотфиксирующих бактерий цитохром bd вносит вклад в защиту нитрогеназы от инактивации кислородом [34-36]. Также обнаружено, что ци-тохром bd оксидаза расширяет диапазон концентраций кислорода, при котором могут расти аноксигенные фототрофные бактерии [37]. Более того, цитохром bd-I из E. coli участвует в регуляции процесса образования дисульфидных связей при сворачивании белков [38], а также биосинтеза гема (а именно на уровне фермента протопорфириноген IX оксидазы) [39].
Трехмерная структура цитохрома bd пока неизвестна. Этот фермент не проявляет гомологии ни с одной из гем-медных или альтернативных цианид-резистентных терминальных оксидаз [1, 7, 40, 41]. Ферменты из E. coli и Azotobacter vinelandii в основном изолируют в виде стабильных оксигенированных комплексов [42-44]. Это, вероятно, происходит из-за высокого сродства фермента к кислороду [45, 46]. Наиболее подробно изучен цитохром bd-I из E. coli. До последнего времени считалось, что фермент состоит только из двух разных интегральных мембранных полипептидов, субъединиц I (CydA, 57 кДа) и II (CydB, 43 кДа). Однако совсем недавно было показано, что цитохром bd содержит дополнительный полипептид CydX (4 кДа) [47, 48]. Предполагается, что этот маленький полипептид - третья субъединица оксидазы, поскольку он необходим для поддержания активности фермента и стабилизации гемовых прос-тетических групп [47-49].
В цитохроме bd не обнаруживают меди, однако он содержит три редокс-активных гема:
низкоспиновый гем b558 и высокоспиновые ге-мы b595 и d [50, 51]. Гем b558 расположен на субъединице I, тогда как гемы b595 и d, вероятно, находятся в районе контакта субъединиц I и II [52]. Согласно современным представлениям, все три гема расположены ближе к внешней (пе-риплазматической) стороне мембраны [53]. Гек-сакоординированный гем b558, по-видимому, вовлечен в окисление хинола, в то время как гем d связывает молекулярный кислород, принимая непосредственное участие в его четырехэлект-ронном восстановлении до H2O. Роль пента-координированного гема b595 до сих пор остается невыясненной; некоторые авторы предположили, что его функция — быть посредником в переносе электрона между гемом b558 и гемом d [54, 55]. По мнению других исследователей гем b595 представляет собой второй редокс-центр, способный реагировать с кислородом [56, 57]. Наконец, на ферментах из E. coli и A. vinelandii получены данные, согласно которым гем b595 может участвовать в восстановлении кислорода, образуя вместе с гемом d двухгемовый кислоро-доредуктазный центр, напоминающий гем/Cu би-ядерный центр у гем-медных оксидаз [9, 58—68]. С другой стороны, в цитохроме bd из Geobacillus thermodenitrificans не выявляется значительного взаимодействия между гемами b595 и d в отличие от цитохрома bd-I из E. coli [69]. Это может отражать существенные различия между двумя ферментами в устройстве активного центра.
Общепринято, что в ходе каталитического цикла (рис. 1) цитохром bd претерпевает следующие переходы:
A1 ^ A3 ^ 'P' ^ F ^ O1 ^ A1,
где A1 и A3 — оксигенированные формы восстановленного гема d в ферменте с одним (b5+8 b5+5d2+ - O2) и тремя (b5+8 b5+5 d2+ - O2) электронами соответственно; 'P' — короткоживущее состояние, которое, как полагали изначально, является пероксоинтермедиатом гема d; F - ин-термедиат с феррильной формой гема d (b5+8b5+5d4+ = O2—), O1 — одноэлектронная форма фермента с окисленным гемом d (b5+8 b5+5 d3+ — ОН). В стационарных условиях преобладают формы фермента A1 и F в качестве основных каталитических интермедиатов [70]. В связи с этим, данные интермедиаты обнаруживают в препаратах изолированного и мембраносвязан-ного фермента. В тех же условиях также регистрируется и небольшая фракция интермедиата O1 [70]. A3 и 'P' — короткоживущие соединения, которые при комнатной температуре можно увидеть только с помощью методов быстрой кинетики [10, 11]. О существовании промежуточного
Рис. 1. Каталитический цикл цитохрома bd. Стрелки, изображенные сплошными линиями, показывают ход каталитической реакции. Пунктирные стрелки показывают переходы, которые не являются частью каталитического цикла
соединения 'Р' впервые сообщили Белевич с со-авт. [10]. Соединение 'Р', возможно, представляет собой феррильный интермедиат, но с п-кати-он-радикалом на порфириновом кольце гема d и электроном на геме Ь558 (^+^5+d*4+ = О2-) [71]. Полностью окисленная (О, Ь5+8 Ь5+^3+ — ОН) и полностью восстановленная (Я3, Ь5+8Ь5+5d2+) формы (рис. 1), скорее всего, не являются ин-термедиатами каталитического цикла [70—72], но могут быть получены искусственно. Стоит заметить, что феррильный комплекс цитохро-ма d, очень похожий по спектральным свойствам на истинный каталитический интермеди-ат F [10, 11], можно получить добавлением избытка перекиси водорода к ферменту, окисленному на воздухе либо обработанному липофиль-ным окислителем [8, 73—75]. В последнем случае реакция с перекисью водорода происходит довольно быстро с наблюдаемой константой скорости второго порядка к, равной 600 М-1 с-1 [74].
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С ПЕРЕКИСЬЮ ВОДОРОДА (Н2О2)
Большой объем данных свидетельствует о том, что цитохром bd вносит вклад в устойчивость бактерий к окислительному стрессу, вызываемому перекисью водорода. Мутанты E. coli, лишенные цитохрома bd, чрезвычайно чувствительны к Н2О2 [33]. Соответственно, уровень экспрессии цитохрома bd у E. coli возрастает под воздействием перекиси [76]. Коршунов и Имлей
[77], используя штамм E. coli, лишенный некоторых антиоксидантных ферментов (каталаз KatG и KatE и НАДН-пероксидазы Ahp), показали, что фермент типа bd понижает образование внутриклеточной Н2О2 при внезапном переходе от анаэробных к аэробным условиям роста. Авторы предположили, что цитохром bd выполняет эту функцию опосредованно, забирая восстановительные эквиваленты у фумарат-редук-тазы, ключевого генератора Н2О2 [77].
Недавно мы обнаружили, что цитохром bd-I из
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.