УДК 616.344-002-031.84,616.348-002.44
ЦИТОКИНОВЫЙ ПРОФИЛЬ У ДЕТЕЙ С ВОСПАЛИТЕЛЬНЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ КИШЕЧНИКА
© 2014 А.П. Топтыгина13*, Е.Л. Семикина24, Г.В. Бобылева1, Л.В. Мирошкина2, С.В. Петричук2
1 Институт им. Т.Н. Габричевского Роспотребнадзора, 125212 Москва, ул. Адм. Макарова, 10; факс: +7(495)452-1830, электронная почта: toptyginaanna@rambler.ru
2 Централизованная клинико-диагностическая лаборатория «Научный центр здоровья детей» РАМН, 119991 Москва
3 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, 119991 Москва
4 Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова, 117997 Москва
Поступила в редакцию 02.07.14
Болезнь Крона (БК) и язвенный колит (ЯК) относятся к воспалительным заболеваниям кишечника (ВЗК) и характеризуются иммунной реактивностью против микробных и собственных антигенов. Целью работы было изучение цитокинового профиля в сыворотке крови и копроэкстрактах детей с БК и ЯК. Когорту исследованных пациентов составили 17 пациентов с БК (группа 1), 17 пациентов с ЯК (группа 2) и 18 контрольных пациентов с дисбиозом кишечника. Диагноз ЯК и БК был поставлен согласно общепринятым клиническим и эндоскопическим критериям. Содержание 13 цитокинов (1Ь-1р, 1Ь-2, 1Ь-4, 1Ь-5, 1Ь-6, 1Ь-7, 1Ь-8, 1Ь-10, 1Ь-12р70, 1Ь-17А, ТМБ-а, ТОБ-Р и №N-7) было измерено с помощью ВюР1ех технологии в сыворотке крови и копроэкстрактах пациентов. Уровень 1Ь-17А был значимо повышен, а ТОБ-Р — значимо снижен в сыворотке крови у пациентов с ВЗК. Изменения в цитокиновом профиле в копроэкстрактах касались широкого спектра цитокинов. В копроэкстрактах пациентов с ВЗК уровень провоспалительных цитокинов, таких как 1Ь-2, 1Ь-4, 1Ь-6, 1Ь-12р70, TNF-а и №N-7 был повышен в 6—9 раз, тогда как противовоспалительный цитокин 1Ь-10 был повышен в три раза. Цитокиновый баланс был сдвинут в сторону провоспалительных цитокинов. Количество ТОБ-Р было повышено в 9 раз, а 1Ь-17А — в три раза. Цитокиновый профиль в копроэкстрактах оказался более информативным, чем в сыворотке крови. Оценка цитокинов в копроэк-страктах является простым и неинвазивным методом.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: цитокины, интерлейкин, болезнь Крона, язвенный колит, дети.
Болезнь Крона (БК) и язвенный колит (ЯК), объединенные в группу воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК), представляют собой хронические рецидивирующие неинфекционные заболевания кишечного тракта, приводящие к необратимым нарушениям его структуры и функции [1]. В настоящее время нет единого взгляда на этиологию и патогенез ВЗК. Известно, что микрофлора кишечника играет важную роль в регуляции местного иммунитета. Постоянные взаимодействия кишечного эпителия и нормальной микрофлоры кишечника поддерживают гомеостаз эпителия и защищают от патогенных микроорганизмов, препятствуя развитию воспаления в кишечнике [2]. У пациентов с ВЗК этот деликатный баланс нарушен, что является
* Адресат для корреспонденции.
одним из триггерных механизмов, запускающих воспаление. Дисбиоз кишечника рассматривается некоторыми исследователями как возможный этиологический предшественник ВЗК [3, 4]. Несколькими независимыми группами исследователей было показано, что при ВЗК снижается количество микроорганизмов типа Firmicutes [5, 6], ярким представителем которых является Faecalibacteriumprausnitzii, также снижается количество Bacteroides [7, 8], характерным представителем которых является Bacteroides fragilis. Представители этих двух типов микроорганизмов составляют до 90% всей нормальной микрофлоры кишечника. В то же время при ВЗК повышается общее количество микроорганизмов, в том числе и потенциально патогенных, например, типа Actinobacteria и Proteobacteria, в частности, различные представители Escherichia coli [9].
Несостоятельность функций эпителиального барьера кишечника, обусловленная генетическими нарушениями механизмов врожденного иммунитета [10], приводит к активации анти-ген-презентирующих клеток, что сопровождается мощным выбросом провоспалительных ци-токинов и привлекает в очаг воспаления нейт-рофилы, Т- и В-лимфоциты [11, 12]. Существует представление о том, что БК является Т-хел-пер (Th) 1 — опосредованным заболеванием, поскольку в биоптатах пораженной кишки было обнаружено повышение содержания цитокинов типа Th1, таких как интерлейкин (IL)-12, интерферон (IFN)-y и фактор некроза опухолей (TNF)-а [13, 14]. В то же время ЯК рассматривали как заболевание типа Th2, так как при этом заболевании в кишечной стенке чаще обнаруживали повышение концентрации цитокинов типа Th2, таких как IL-5 и IL-13, при этом не наблюдалось четкого повышения IL-4 [13, 14]. Однако в последнее время все больше свидетельств о том, что внутри этих двух нозологий существуют различные подтипы, связанные с разными вариантами иммунопатогенеза ВЗК. Несколько лет назад была установлена особая роль Th17- и Treg-лимфоцитов в патогенезе ВЗК
[15]. Согласно данным исследований, содержание ^П-лимфоцитов в стенке кишки пациентов с БК значительно увеличено, вследствие чего наблюдается гиперпродукция IL-17A, IL-17F, IL-22, IL-21, IL-26. Цитокины семейства IL-17 обладают провоспалительным действием, являясь мощными хемоаттрактантами для нейтро-филов и индукторами синтеза IL-6 и TNF-a
[16]. Провоспалительным цитокинам IL-1a, IL-1ß, IL-2, -6, -8, -12, -17, -23, IFN-y, и TNF-a приписывается важная роль в инициации и прогрессировании ВЗК. Противовоспалительные цитокины, такие как IL-10 и трансформирующий фактор роста (TGF)-ß также вносят свой вклад в патогенез заболевания. Превалирование цитокинов того или иного типа рассматривается как один из вариантов иммунопатоге-неза ВЗК [17].
Несмотря на то, что многие группы авторов представляли результаты исследований различных цитокинов при ВЗК, но это касалось в основном содержания цитокинов в сыворотке крови, а также продукции цитокинов лимфоцитами периферической крови или полученными из биоптатов кишечника больных ВЗК. При этом цитокины в сыворотке крови отражают суммарную реакцию организма на все иммунные процессы (не только ВЗК), происходящие в организме. Продукция цитокинов лимфоцитами периферической крови отражает потенциальную возможность данного индивидуума про-
дуцировать цитокины, что также не напрямую отражает ситуацию в кишечнике. Продукция цитокинов лимфоцитами, полученными из био-птатов кишечника, более точно отражает картину воспаления in situ, однако существуют серьезные ограничения для получения материала для такого исследования. Сложность изучения материалов биопсии у детей с ВЗК обусловлена прежде всего выраженной инвазивностью коло-носкопии, а также необходимостью применения общей анестезии, тем самым ограничивающей проведение данной процедуры не чаще одного раза в полгода. Кроме того забор биоптатов сопряжен с субъективной оценкой наиболее пораженного участка кишки врачом-эндоскопистом и может существенно повлиять на достоверность результатов исследования.
Целью настоящей работы было изучение возможности определения цитокинов в водно-солевых копроэкстрактах для дальнейшего использования этого метода при обследовании больных с ВЗК.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Обследованы 52 ребенка (29 мальчиков и 23 девочки) в возрасте от 7 до 17 лет. Из них 17 детей с болезнью Крона (группа 1), 17 детей с язвенным колитом (группа 2) и 18 детей проходили обследование в связи с дисбиозом кишечника и составили контрольную группу 3. У детей групп 1 и 2 диагнозы устанавливали на основании анамнестических, клинико-лабораторных, эндоскопических и гистологических данных. Длительность заболевания на момент обследования варьировала от 1 мес до 13 лет и в среднем составила 4 года. У детей группы 3 для верификации диагноза проводили микробиологический посев кала.
Биологический материал для определения уровня цитокинов в сыворотке крови у детей получали с помощью системы для забора крови BDVаcutаiner®. Для получения водно-солевого копроэкстракта один объем фекалий смешивали с тремя объемами забуференного фосфатами физиологического раствора, перемешивали, осаждали центрифугированием 15 мин при 3000 об/мин (разведение составляло 1 : 4 в контрольной группе), для детей групп 1 и 2 разведение составляло 1 : 40, так как известно, что у больных ВЗК отмечается высокий уровень цитокинов. Надосадок использовали для определения концентрации цитокинов.
Содержание в сыворотке крови и водно-солевом копроэкстракте 13 цитокинов (1Ь-1р, 1Ь-2, ТЬ-4, ТЬ-5, ТЬ-6, ТЬ-7, ТЬ-8, ТЬ-10, ТЬ-12р70, ТЬ-17Л,
TNF-a, TGF-p и IFN-y) оценивали на двулуче-вом лазерном автоматическом анализаторе (Bio-Plex Protein Assay System, «BioRad», США) с использованием коммерческих тест-систем (определяемый динамический диапазон 0,2—3200 пг/мл) [18].
Полученные результаты были статистически обработаны с использованием непараметрических методов (критерий Манна—Уитни) и методов описательной статистики. Значимыми считали различия прир < 0,05. Расчеты проводили с использованием компьютерных программ «Microsoft Office Excel 2003» и «Statistica 6.0».
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
При микробиологическом исследовании кала в группе 3 обнаружено снижение нормальной флоры: у 55,6% детей было снижено количество лактобактерий, у 33,3% — бифидобактерий и у 27,8% — кишечной палочки. В то же время у 44,4% детей этой группы высевалась гемолизи-рующая кишечная палочка, у 27,7% — клебсиелла и у 33,3% — золотистый стафилококк.
Результаты определения цитокинов в сыворотке крови представлены в табл. 1. Выявлено значимое увеличение содержания 1Ь-17А и снижение концентраций TGF-p (р < 0,05) в группах 1 и 2 по сравнению с контрольной группой. Содержание других исследованных цитокинов не различались во всех трех группах.
В водно-солевых копроэкстрактах не было обнаружено 1Ь-7. Также практически не выявлялся 1Ь-8, кроме трех детей группы 1 и трех детей группы 2, вместе с тем количество данного цитокина у этих детей превышало 800 пг/мл. У большинства детей всех трех групп концентрация 1Ь-5 была на нижней границе определения, но встречались дети с высоким (200—900 пг/мл) содержанием этого цитокина, независимо от диагноза. Возможно, это
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.