УДК 597.553.2.591.05
ЦИТОЛОГИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ ГОНАД И УРОВЕНЬ ТИРЕОИДНЫХ И ПОЛОВЫХ СТЕРОИДНЫХ ГОРМОНОВ У ДВУХ ФЕНОТИПИЧЕСКИХ ФОРМ МОЛОДИ ЧЕРНОМОРСКОЙ КУМЖИ SALMO TRUTTA LABRAX
© 2014 г. Д. С. Павлов, Е. Д. Павлов, Е. В. Ганжа, В. В. Костин, В. Ю. Пономарёва
Институт проблем экологии и эволюции РАН — ИПЭЭ РАН, Москва E-mail: p-a-v@nxt.ru Поступила в редакцию 05.11.2013 г.
Исследованы цитологическое состояние гонад и гормональный статус у двух фенотипических форм (жилой и проходной) молоди черноморской кумжи Salmo trutta labrax в возрасте 15 мес. Выявлены различия в скорости протекания гаметогенеза у сравниваемых форм. Показано, что сперматогенез у жилой формы протекает интенсивнее, чем у проходной, а оогенез, напротив, медленнее. Уровень тироксина и тестостерона в крови кумжи достоверно выше в группах рыб с интенсивно протекающим гаметогенезом. Установлено, что концентрация трийодтиронина у жилой формы несколько ниже, чем у проходной. Выявлена взаимосвязь между содержанием тиреоидных и половых стероидных гормонов.
Ключевые слова: черноморская кумжа Salmo trutta labrax, фенотипические формы, цитология, гонады, сперматогенез, оогенез, тироксин, трийодтиронин, тестостерон, эстрадиол-17р.
DOI: 10.7868/S0042875214030114
У молоди многих лососёвых (Salmonidae), как и у ряда других рыб, существует дифференциация на фенотипические формы — жилые (резидентные) и проходные. При выборе той или иной жизненной стратегии у рыб изменяются биохимические процессы, цитоморфологические показатели и поведение (Jonston, Eales, 1967; Hoar, 1976; McCormic, Saunders, 1987; Казаков, Веселов, 1998; Пустовит, Пустовит, 2005; Quinn, 2005). В этот период у молоди происходят физиолого-биохимические изменения в осморегуляции, половой и нейрогуморальной системах, гематологических показателях и в липидном обмене (Lovern, 1934; Jonston, Eales, 1967; Шульман, 1972; Hoar, 1976; Павлов и др., 2007). Исследователи, как правило, оценивают отдельные показатели, не рассматривая их взаимодействие, в то время как перечисленные показатели тесно связаны между собой (Cyr, Eales, 1996). Для понимания механизмов дифференциации лососей необходимо рассматривать комплекс показателей, характеризующих соответствующий процесс в организме.
Обычно внутрипопуляционная дифференциация на жилую и проходную формы у молоди черноморской кумжи Salmo trutta labrax как в естественной среде обитания, так и в условиях искусственного разведения происходит в возрасте 1+ (Pavlov et al., 2010). Но при наличии внешних условий для дифференциации у молоди черноморской кумжи уже в возрасте 0+ возникают различия в её поведении (Павлов и др., 2010б) и в
скорости обменных процессов в организме (Павлов и др., 2012), которые во многом регулируются тироксином и трийодтиронином. Позже, при появлении визуальных признаков смолтификации (возраст 1+), у черноморской кумжи обнаруживаются различия в содержании ряда гормональных веществ (гормон роста, катехоламины, тиреоид-ные гормоны) (Pavlov et al., 2010). Также известно, что первый нерест у особей жилой и проходной форм кумжи происходит в разном возрасте (Мурза, Христофоров, 1991), что может быть связано с разной скоростью гаметогенеза у этих рыб. Эти факты дают основания полагать, что наряду с гормональными различиями у проходной и жилой формы черноморской кумжи различается и скорость гаметогенеза.
С целью проверки этого предположения в настоящей работе проведено исследование цито-морфологического состояния половых желёз, концентрации половых стероидных гормонов (тестостерона, эстрадиола) и гормонов-регуляторов энергетических процессов в организме (тироксина и трийодтиронина) у молоди черноморской кумжи двух разных фенотипических форм — жилой и проходной.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Работа проведена в июле 2012 г. на племенном форелеводческом заводе "Адлер" (Краснодарский край). Годовиков (15 мес.) черноморской
кумжи содержали в бетонном проточном бассейне при плотности посадки 400—450 экз/м3, температуре воды 10.7—13.2°С и при постоянном кормлении искусственным кормом фирмы BioMar. За сутки до отбора проб на биологический, гистологический и иммуноферментный анализы рыб отсаживали в садок размерами 1.2 х 1.2 х 1.2 м, установленный в этом же бассейне, и прекращали кормление. Для корректного сравнения исследуемых показателей биологический, гистологический и иммуноферментный анализы были проведены на одних и тех же рыбах. Каждый тип анализа проведён на 41 экз. (10 самок и 31 самец) жилой формы и 37 экз. (18 самок и 19 самцов) проходной.
Гистологические препараты изготавливали по стандартным методикам (Ромейс, 1953) с использованием полуавтоматического специализированного гистологического оборудования (Medite, Германия): гистопроцессор TPC-15, заливочная станция TES-99, микротом Meditóme M530. Срезы толщиной 3—5 мкм последовательно окрашивали гематоксилином Эрлиха и эозином. Фотографии продольных срезов краниального участка гонад сделаны с помощью моторизованного микроскопа Keyence Biorevo BZ-9000 (Япония). Стадии зрелости гонад, периодизация сперматогенеза и оогенеза приведены по описанным ранее методикам (Мурза, Христофоров, 1991; Чмилевский, 2003).
Цитологическое состояние гонад оценивали по интенсивности протекания гаметогенеза. Для яичников — по ядерно-цитоплазматическому отношению (ЯЦО), рассчитанному как отношение площади ядра к площади цитоплазматического материала ооцита на срезе, прошедшем непосредственно вблизи от центральной части ооцита. На этапе пре- и вителлогенеза значительно увеличиваются размеры ооцитов, что в основном происходит за счёт цитоплазмы, а не ядра (Мурза, Христофоров, 1991; Макеева, 1992). Поэтому в этот период по мере развития клеток значение ЯЦО снижается. Состояние семенников оценивали по количественному соотношению различных типов половых клеток на единице площади среза (1 мм2). Подсчёт числа клеток и измерения для определения ЯЦО проводили при помощи программного обеспечения Image J ver. 1.46r.
Концентрацию половых стероидных (тестостерон, эстрадиол-17Р) и тиреоидных (тироксин — Т4, трийодтиронин — Т3) гормонов определяли в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа (ИФА). Для установления зависимой динамики содержания Т4 и Т3 в крови применяли показатель отношения данных гормонов друг к другу — Т4/Т3 (Hulbert, 2000; Скударнова и др., 2006).
Пробы крови отбирали утром после рассвета (с 06.40 до 08.20); по нашим неопубликованным данным, это период наибольшей концентрации
гормонов в течение суток. Кровь прижизненно отбирали у рыб из хвостовой вены за анальным плавником в шприц объёмом 1—2 мл; объём пробы в зависимости от размера особи варьировал от 200 до 750 мкл. Далее кровь переливали в стерильные пробирки объёмом 1.5—2.0 мл и отстаивали при комнатной температуре в течение 30—40 мин в вертикальном положении. После образования сгустка кровь центрифугировали в течение 7 мин при скорости 4000 об/мин в центрифуге Minispin (Eppendorf, Германия). Полученную сыворотку отбирали в стерильные пробирки и хранили в морозильной камере при —20°С. Для ИФА использовали следующее оборудование и реагенты: микропланшетный инкубатор-шейкер ST-3L (Elmi, Латвия), полуавтоматический иммунопланшет-ный фотометр StatFax 303 Plus, промыватель-микропланшет StatFax 3100 (AwaresTechnology, США) и соответствующие тест-наборы реагентов (DRG, Германия). Концентрацию гормонов в каждом образце сыворотки крови определяли в трёх повторностях, для последующих расчётов использовали среднее значение.
Обработку материала выполнили по индивидуальным показателям с использованием дисперсионного, регрессионного и корреляционного анализов, а также критериев Стьюдента — для сравнения средних и Фишера — для сравнения вариабельности.
РЕЗУЛЬТАТЫ Длина и масса молоди черноморской кумжи
В возрасте 15 мес. особи жилой и проходной формы черноморской кумжи различаются по окраске, длине и массе тела. Жилая форма имеет тёмно-оливковую окраску тела с тёмными пятнами. Проходная форма характеризуется однородной серебристой окраской тела. Длина (по Смитту, АС) и масса особей проходной формы заметно больше (p < 0.05), чем жилой (табл. 1). Результаты дисперсионного анализа показывают, что длина и масса у исследованных рыб достоверно зависят от их пола (р < 0.05) и фенотипической формы (р < < 0.001). Аналогичные результаты даёт и попарное сравнение средних по критерию Стьюдента: различия достоверны по длине и по массе тела у самок и у самцов, и по длине тела — у жилых и проходных самок (p < 0.05).
Цитологическое состояние половых желёз
Самки. Яичники годовиков черноморской кумжи обеих фенотипических форм находятся на II стадии зрелости, они полупрозрачны, имеют слегка желтоватый цвет, утолщены по всей длине. Вдоль яичника проходит крупный кровеносный сосуд с мелкими ответвлениями. Половые клетки представлены ооцитами периода превителлоге-
Таблица 1. Длина и масса тела двух фенотипических форм черноморской кумжи Salmo trutta labrax в возрасте 15 мес.
Показатели Жилая форма Проходная форма
самки самцы самки самцы
Длина (АС), см Масса тела, г Число рыб, экз. 1 5.5 ± 1.5 3a 13 .9 -18 .3 3 7.5 ± 13 . 29a 22 .3 -62.6 10 15 .6 ± 2.1 3a 12 .1 -19 .8 40.2 ± 16. 88 а'в 1 9.0 -76.5 31 1 7.9 ± 1.9 9б 15 .0 -21 .7 5 2.0 ± 18 . 75б' в 23 .2 -8 9.7 18 1 8 .7 ± 2.0 1б 15 .2 -22 .6 6 0.7 ± 21 . 80б 27.1 -11 2.2 19
Примечание. Одинаковыми буквами (а—в) обозначены группы рыб с недостоверными различиями средних по критерию Стьюдента (р > 0.05). Здесь и в табл. 2: над чертой — среднее значение показателя и его среднее квадратичное отклонение, под чертой — пределы варьирования показателя.
неза, отдельные крупные клетки видны невооружённым глазом. Ооциты в гонадах кумжи значительно варьируют по размерам, что обусловлено асинхронной скоростью их развития в данный период (рис. 1а). В одном и том же яичнике присутствуют как мелкие клетки, только вступающие в период протоплазматического роста, так и немногочисленные крупные ооциты с вакуолизиро-ванной периферической зоной цитоплазмы (рис. 1б). Цитоплазмы в мелких клетках мало, она равномерно окрашена. У других, более многоч
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.