ОНТОГЕНЕЗ, 2015, том 46, № 5, с. 338-345
= МОРФОГЕНЕЗ =
УДК 597.553.2.591.05
ЦИТОЛОГИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ ГОНАД И УРОВЕНЬ ТИРЕОИДНЫХ И ПОЛОВЫХ СТЕРОИДНЫХ ГОРМОНОВ У ПЕСТРЯТОК ЧЕРНОМОРСКОЙ КУМЖИ SALMO TRUTTA LABRAX
© 2015 г. Е. Д. Павлов, Е. В. Ганжа, В. В. Костин, Д. С. Павлов
Институт проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова РАН 119071 Москва, Ленинский пр., д. 33 E-mail: p-a-v@nxt.com Поступила в редакцию 17.03.2015 г.
Окончательный вариант получен 20.03.2015 г.
Исследованы цитологическое состояние гонад и гормональный статус у еще недифференцированной на жилую и проходную формы заводской черноморской кумжи (пестрятки) в возрасте 15 мес. Показано, что гормональные изменения, связанные с выбором жизненной стратегии у самок и самцов черноморской кумжи выражены в разной мере. По сравнению с особями жилой и проходной форм самки пестряток характеризуются низкой скоростью оогенеза и сходным гормональным статусом, а самцы пестряток — средней скоростью сперматогенеза, низким уровнем тиреоидных гормонов и эстрадиола и средним уровнем тестостерона. Выявлено, что из недифференцированных рыб в дальнейшем будут формироваться преимущественно особи жилой формы черноморской кумжи.
Ключевые слова: черноморская кумжа, внутрипопуляционная дифференциация, пестрятки, гамето-генез, тиреоидные гормоны, половые стероидные гормоны.
БОТ: 10.7868/80475145015050079
ВВЕДЕНИЕ
У молоди черноморской кумжи Salmo trutta la-brax внутрипопуляционная дифференциация на жилую и проходную формы происходит в возрасте 1+, как в естественной среде обитания, так и в условиях искусственного разведения (Pavlov et al., 2010). Продолжительность дифференциации при заводском выращивании черноморской кумжи, как правило, составляет несколько месяцев (Pavlov et al., 2010; Павлов и др., 2012), что обусловлено выраженными физиологическими различиями особей в генерации. В возрасте 15 мес. в генерации присутствуют особи трех форм: исходная форма (без внешних признаков дифференциации) — пестрятки, и две образовавшиеся (с признаками внешней дифференциации) — жилая и проходная формы (Павлов и др., 2014) В отличие от особей сформированных фенотипических форм пестрятки имеют меньшие размеры и сероватую с оливковым оттенком окраску, разделенную черными поперечными полосами вдоль тела (Pavlov et al., 2010).
Ранее было показано (Павлов и др., 2014), что жилая форма черноморской кумжи в возрасте 15 мес. характеризуется более интенсивно протекающим сперматогенезом, но более медленным оогенезом по сравнению с проходной. Уровень тироксина и тестостерона в крови черноморской кумжи достоверно выше у рыб с интенсивно про-
текающим гаметогенезом, а концентрация трий-одтиронина у жилой формы немного ниже, чем у проходной (Павлов и др., 2014). Состояние половых желез, скорость протекания гаметогенеза, уровень тиреоидных и половых стероидных гормонов у пестряток ранее не оценивали. Изучение этих особенностей позволит определить степень подготовленности пестряток к дифференциации и, возможно, ее направление.
Цель работы — изучить состояние половых желез, уровень половых стероидных гормонов (тестостерона, эстрадиола) и гормонов-регуляторов энергетических процессов (тироксина и трийодти-ронина) у пестряток в возрасте 15 мес. и сравнить их по этим показателям с ранее изученными особями жилой и проходной форм того же возраста.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Работа проведена в июле 2012 г. на племенном форелеводческом заводе "Адлер" (Краснодарский край). Сравнительный анализ пестряток с молодью уже выбравшей проходную или жилую жизненную стратегию провели по биологическим, цитоморфологическим, биохимическим параметрам. Пробы были взяты в одни и те же дни у рыб из одной генерации (Павлов и др., 2014).
Пестряток черноморской кумжи в возрасте 15 мес. содержали в бетонном проточном бассей-
не при плотности посадки 400—450 экз./м3 и температуре воды 10.7—13.2°С. Рыб кормили искусственным кормом фирмы BioMar. За сутки до отбора проб на биологический, гистологический и иммуно ферментный (ИФА) анализы особей отсаживали в садок размерами 1.2 х 1.2 х 1.2 м, установленный в этом же бассейне, чтобы предотвратить доступ рыб к корму. Это необходимо для стандартизации полученных результатов по ИФА. Для корректного сравнения данных анализы проведены на одних и тех же 31 особях (20 самок и 11 самцов).
Гистологические препараты изготавливали по стандартным методикам (Ромейс, 1953) с использованием полуавтоматического специализированного гистологического оборудования фирмы Medite (Германия): гистопроцессор TPC-15, заливочная станция TES-99, микротом Meditome M530. Срезы толщиной 3—5 мкм последовательно окрашивали гематоксилином Эрлиха и эозином. Фотографии продольных срезов краниального участка гонад сделаны с помощью моторизованного микроскопа Keyence Biorevo BZ-9000 (Япония). Стадии зрелости гонад, периодизация сперматогенеза и оогенеза приведены по Мурза, Христофорову (1991) и Чмилевскому (2003).
Цитологическое состояние гонад оценивали по интенсивности протекания гаметогенеза. Для яичников — по ядерно-цитоплазматическому отношению (ЯЦО), рассчитанному как отношение площади ядра к площади цитоплазматического материала ооцита на срезе, прошедшем непосредственно вблизи от центральной части ооцита. На этапе пре- и вителлогенеза значительно увеличиваются размеры ооцитов, что в основном происходит за счет цитоплазмы, а не ядра (Мурза, Христофоров, 1991; Макеева, 1992). Поэтому в этот период по мере развития клеток значение ЯЦО снижается. Состояние семенников оценивали по количественному соотношению различных типов половых клеток на единице площади среза (1 мм2). Подсчет числа клеток и измерения для определения ЯЦО проводили при помощи программного обеспечения Image J ver. 1.46r.
Концентрацию половых стероидных (тестостерон, эстрадиол-17ß) и тиреоидных (тироксин — Т4, трийодтиронин — Т3) гормонов определяли в сыворотке крови. Пробы крови отбирали утром после рассвета (с 06:40 до 08:20) в период наибольшей концентрации гормонов (Ганжа и др., 2015). Кровь прижизненно отбирали у рыб из хвостовой вены за анальным плавником шприцом объемом 1—2 мл; объем пробы в зависимости от размера особи варьировал от 200 до 750 мкл. Далее кровь переливали в стерильные пробирки и отстаивали при комнатной температуре в течение 30—40 мин в вертикальном положении. После образования сгустка кровь центрифугировали в течение 7 мин при скорости 4000 об/мин в центрифуге Minispin (Eppendorf, Германия). Полученную сыворотку
отбирали в стерильные пробирки и хранили в морозильной камере при —20°С. Для ИФА использовали: микропланшетный инкубатор-шейкер ST-3L (Elmi, Латвия), полуавтоматический имму-нопланшетный фотометр StatFax 303 Plus, промыва-тель микропланшет StatFax 3100 (AwaresTechnology, США) и соответствующие тест-наборы реагентов производства компании DRG (Германия). Концентрацию гормонов в каждом образце сыворотки крови определяли в трех повторностях, для последующих расчетов использовали среднее значение.
Обработка материала выполнена по индивидуальным показателям с использованием дисперсионного и кластерного (по методу Уорда) анализов, а также критериев Стьюдента, Стьюдента для долей и Фишера.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Самки пестряток имели длину 13.2 ± 1.01 1
(11.2-15.2) см и массу 22.7 ± 5.42 (13.4-35.0) г, а самцы - 13.3 ± 1.24 (11.2-14.9) см и 22.4 ± 5.47 (12.0-30.4) г соответственно. Различия между самками и самцами по этим показателям не достоверны (критерии Стьюдента и Фишера, р > 0.05).
Длина (AC) и масса тела пестряток достоверно меньше (p < 0.01, критерий Стьюдента), чем у проходной и жилой формы того же возраста (Павлов и др., 2014). Данные дисперсионного анализа показывают, что у пестряток, также как и у рыб, уже определившихся с жизненной стратегией, длина и масса достоверно зависят от их феноти-пической формы (р < 0.001), и у самок и самцов одной формы эти зависимости разные (р < 0.05).
Доля самцов в выборке уменьшается в ряду: жилые (77.7%) - проходные особи (51.4%) -пестрятки (35.5%). Жилые особи по этому показателю достоверно отличаются от остальных форм по критерию Стьюдента для долей (р < 0.015).
Цитологическое состояние половых желез. Яичники пестряток находятся на II стадии зрелости, они полупрозрачны, имеют слегка желтоватый цвет, утолщены по всей длине. Половые клетки представлены ооцитами периода превителло-генеза, они значительно варьируют по размерам, что обусловлено асинхронностью их развития. В одном и том же яичнике присутствуют как мелкие клетки диаметром от 15 мкм, только вступающие в период протоплазматического роста, так и немногочисленные крупные ооциты (диаметр 200250 мкм), с вакуолизированной периферической зоной цитоплазмы. Цитоплазмы в мелких клетках мало, она равномерно окрашена. У более многочисленных клеток среднего размера, в цитоплазме хорошо видны периферические зоны локализации РНК, более интенсивно окрашивающиеся гематоксилиновым лаком. У крупных
1 Здесь и далее: перед скобками средняя и ее ошибка, в скобках - min и max.
340
ПАВЛОВ и др.
<ч о н
и
я
о
о «
ч о
П
45 40 35 30 25
20 -
15 10 5
0
□ Пестрятки
0.5 ЯЦО
Жилая форма
□ Проходная форма
Рис. 1. Распределение ооцитов по ядерно-цитоплазматическому отношению (ЯЦО) в гонадах черноморской кумжи Salmo trutta labraxв возрасте 15 мес. Здесь и далее данные по жилой и походной формам приведены по Павлову и др., 2014.
ооцитов эти зоны отсутствуют. Качественный и количественный состав ооцитов сходен у пестря-ток и особей жилой и проходной формы черноморской кумжи (Павлов и др., 2014).
ЯЦО ооцитов в гонадах пестряток составляет 0.36 ± 0.008 (0.11-0.88) (рис. 1). Этот показатель у пестряток достоверно выше (p < 0.01), чем у жилой и проходной формы. Более 41% всех ооцитов в гонадах пестряток имеют показатель ЯЦО < 0.3, характеризующий более продвинутые по развитию половые клетки. У жилой и проходной формы эта доля выше — 45.7 и 59.1% соответственно. Различия достоверны (р < 0.01) по критерию Сть-дента для долей. Полученные данные свидетельствуют о том, что половые железы у пестряток развиваются несколько менее интенсивно,
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.