ОНТОГЕНЕЗ, 2013, том 44, № 6, с. 381-388
БИОЛОГИЯ РАЗВИТИЯ МЛЕКОПИТАЮЩИХ
УДК 611-013;57.086.835;577.218
ЦИТОТОКСИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ ЭТОПОЗИДА НА РАЗНЫХ СТАДИЯХ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ ЭМБРИОИДНЫХ ТЕЛ, СФОРМИРОВАННЫХ ЭМБРИОНАЛЬНЫМИ СТВОЛОВЫМИ КЛЕТКАМИ МЫШИ1
© 2013 г. О. Ф. Гордеева
Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН 119334 Москва, ул. Вавилова, д. 26 E-mail: olgagordeeva@yandex.ru Поступила в редакцию 07.07.13 г.
Окончательный вариант получен 10.07.13 г.
Начальные стадии in vitro дифференцировки эмбриональных стволовых клеток рассматривают в качестве уникальных трехмерных моделей раннего развития млекопитающих для фундаментальных, фармакологических и токсикологических исследований. Ранее было показано (Гордеева, 2012), что оценка эмбриотоксичности на модели недифференцированных эмбриональных стволовых клеток может быть недостаточно точной при прогнозировании токсических воздействий на эмбрионы млекопитающих, поэтому мы провели сравнительное изучение повреждающих эффектов на примере цитостатика этопозида в недифференцированных эмбриональных стволовых клетках и эмбрио-идных телах разных стадий дифференцировки, которые имеют сходные трехмерные структуры с ранними эмбрионами. Анализ роста, клеточной гибели и динамики дифференцировки недифференцированных эмбриональных стволовых клеток и эмбриоидных тел, подвергшихся воздействию этопозида, показал, что цитостатические и цитотоксические эффекты этопозида являются стадие-специфическими. Максимальные повреждающие эффекты этопозида выявлены в недифференцированных эмбриональных стволовых клетках, а в процессе роста и дифференцировки эмбриоидных тел степень его цитотоксичности снижается. Мы предполагаем, что увеличение клеточного объема эмбриоидных тел и развитие гипертрофированного слоя внезародышевой энтодермы приводят к снижению диффузии, транспорта и метаболизма химических и биологически активных веществ и препятствуют действию повреждающих факторов.
Ключевые слова: эмбриоидные тела, эмбриональные стволовые клетки, этопозид, цитостатики, ци-тотоксичность, эмбриотоксичность дифференцировка.
DOI: 10.7868/S0475145013060037
Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) млекопитающих представляют собой уникальную in vitro модель раннего развития млекопитающих для фундаментальных, фармакологических и токсикологических исследований. В исследованиях механизмов раннего развития млекопитающих с использованием модели in vitro дифференцировки ЭСК важную роль играет экспериментальное трехмерное (3D) воспроизведение межклеточных взаимодействий в эмбриональных клеточных субпопуляциях, т.к. 3D-модели наиболее адекватно отражают процессы, протекающие в биологических объектах (Yamada et al., 2007).
На ранних стадиях дифференцировки ЭСК формируют клеточные сфероиды — эмбриоидные тела (ЭТ), которые являются аналогами эмбрионов
1 Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (проект № 11-04-00379-а).
на предгаструляционных стадиях развития. Несмотря на отсутствие трофобласта в ЭТ 3D-структу-ры ЭТ начальных стадий дифференцировки имеют значительное сходство с 3D-структурами эмбрионов на стадиях морулы, бластоцисты и раннего яйцевого цилиндра. В процессе диффе-ренцировки ЭТ происходит реорганизация их 3D-структуры: формируется внешний слой вне-зародышевой энтодермы и внутренний слой эпи-бласт-подобных клеток, в котором дифференцируются клетки-предшественники трех зародышевых листков (Ducibella et al., 1975; Gardner, 1982; Гордеева и др., 2002). В дифференцирующемся "двухслойном" ЭТ изменяются взаимодействия между соседними клетками и клетками разных слоев, что оказывает влияние на межклеточный транспорт сигнальных белков и низкомолекулярных веществ (Sachlos et al., 2008; Van Winkle et al., 2012). В связи с этим в исследованиях молекуляр-
ных механизмов, регулирующих процессы специализации клеток-предшественников трех зародышевых листков и внезародышевых структур, а также при изучении фармакологических и токсикологических эффектов различных химических веществ и лекарственных препаратов необходимо учитывать изменения 3Э-структуры и межклеточных коммуникаций в ЭТ в процессе диффе-ренцировки.
В исследованиях влияния цитостатиков на плюрипотентные клетки и бластоцисты мыши было установлено, что цитостатики разных групп вызывали сильный цитотоксический эффект в недифференцированных ЭСК и клетках внутренней клеточной массы бластоцист, тогда как дифференцирующиеся ЭСК и клетки трофобласта бластоцист были менее чувствительны к повреждающим эффектам (Гордеева, 2012). Кроме того, бластоцисты с интактной 3Э-структурой продолжали нормальное развитие в течение 48 ч после воздействия цитостатиков. Эти данные свидетельствуют о том, что 3Э-структура ранних эмбрионов и различная чувствительность клеток разных эмбриональных популяций к химическим веществам являются ключевыми элементами защиты эмбрионов от повреждающих факторов. В связи с полученными результатами возник вопрос о формировании защитных механизмов от повреждающих факторов в аналогах ранних эмбрионов — ЭТ разных стадий дифференцировки. Поэтому целью данной работы являлось исследование эффектов биологически активных веществ в ЭТ разных стадий дифференцировки с различной 3Э-структурой на примере изучения прямых и отсроченных повреждающих эффектов цито-статика этопозида.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Культивирование ЭСК in vitro. В работе были использованы ЭСК мыши линии R1, ранее любезно предоставленные доктором А. Макларен (А. McLaren, WTCR Institute of Cancer and Developmental Biology, Cambridge, UK). Для поддержания в недифференцированном состоянии ЭСК мыши культивировали в среде DMEM, содержащей 2 тМ L-глутамина, 0.1 тМ заменимых аминокислот, 0.1 мМ Р-меркаптоэтанола и 15% телячьей фетальной сыворотки ("HyClone", США). Недифференцированные плюрипотентные стволовые клетки мыши поддерживали на фидере из первичных эмбриональных фибробластов мыши (МЭФ), инактивированных митомицином С (10 мкг/мл) ("Sigma", США), как описано ранее (Гордеева и др., 2009). В ходе экспериментов ЭСК мыши культивировали в бесфидерной системе, в среде с фактором ингибирования лейкемии (leukemia inhibitory factor, LIF, 10 нг/мл) ("Sigma", США).
Получение эмбриоидных тел. Для получения стандартных ЭТ использовали метод "висячей капли". Для формирования сфероидов на крышку чашки Петри помещали капли среды, содержащие 300 клеток. Для формирования и культивирования ЭТ использовали среду для поддержания ЭСК мыши без добавления LIF. Сформированные в течение трех суток культивирования ЭТ собирали из капель, переносили в планшеты с низкоадгезивной поверхностью для дальнейшего культивирования и дифференцировки в течение 10 дней. На 1, 5 и 10 дни культивирования ЭТ (ЭТ1, ЭТ5 и ЭТ10) переносили в новые планшеты и подвергали воздействию этопозида ("Sigma", США).
Изучение эффектов этопозида в ЭСК и ЭТ. Для изучения цитостатических и эмбриотоксических эффектов этопозида в ЭСК и ЭТ разных стадий развития были выбраны две активные дозы 1 и 10 цМ на основании данных литературы из базы данных TOXNET, U.S. National Library of Medicine, National Institutes of Health (http://toxnet. nlm.nih.gov/) и наших предыдущих исследований (Гордеева, 2012). Все эксперименты проводили в трех сериях.
Недифференцированные ЭСК, ЭТ1, ЭТ5 и ЭТ10 (n = 30) культивировали в течение 24 ч в среде, содержащей 1 и 10 ^М этопозида. После завершения экспериментов подсчитывали число выживших ЭСК и измеряли диаметры ЭТ в контрольных и опытных группах для определения их объемов.
Для изучения отсроченных эффектов этопози-да ЭСК и ЭТ разных стадий развития, подвергшиеся воздействию этопозида, отмывали средой DMEM трижды и культивировали в течение последующих 72 ч в среде без этопозида (24 + 72 ч). По завершении экспериментов подсчитывали число выживших ЭСК и измеряли диаметры ЭТ.
Для оценки эффектов этопозида в сфероидах вычисляли изменения объемов ЭТ в опытных группах по отношению к соответствующей контрольной группе. Статистический анализ размеров ЭТ проводили с использованием ANOVA и парного критерия Стьюдента. Различия считали достоверными при вероятности нулевой гипоте-зыр < 0.001.
Анализ клеточной гибели в ЭТ. Ранние и поздние стадии клеточной гибели исследовали в ЭТ разных стадий развития в контрольных и экспериментальных группах, используя набор для выявления апоптотических и некротических клеток Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V Alexa Fluor 488 and Propidium Iodide for Flow Cytometry ("Molecular Probes", США). Клетки на ранних стадиях апоптоза выявляли с помощью данного набора, используя реакцию связывания фосфатидилсе-рина в мембранах апоптотических клеток с ре-
комбинантным аннексином V, конъюгирован-ным с флуорохромом Alexa Fluor 488. Клетки на поздних стадиях апоптоза и некроза выявляли при окраске йодидом пропидия. Живые клетки не окрашиваются этими компонентами набора. ЭТ инкубировали в растворе аннексина V и йоди-да пропидиума в течение 15 мин, следуя протоколу производителя. После окраски ЭТ помещали в 18-луночные планшеты со стеклянными лунками (Ibidi, Германия) и сразу анализировали на конфокальном микроскопе Leica TSC SP5 l ("Leica Mycrosystems GmbH", Германия).
Иммуногистохимический анализ. Экспрессию транскрипционных факторов Oct4 и Gata4 в ЭТ выявляли с помощью иммунофлуоресцентного анализа по методике, описанной ранее (Гордеева и др., 2009). Для выявления экспрессии белков Oct4 и Gata4 использовали антитела к этим белкам в разведениях 1 : 100 ("Santa Cruz Biotechnology", США). В качестве вторичных антител использовали антитела цыпленка против кроличьих иммуноглобулинов кролика и козы, конъюгиро-ванные флуорохромами Alexa 594 и Alexa 488, в разведении 1:900 ("Molecular Probes", США). После просветления в глицерине ЭТ сканировали на конфокальном микроскопе Leica TSC SP5.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Анализ клеточного роста в ЭСК и ЭТ разных стадий дифференцировки, подвергшихся воздействию этопозида. Исследование цитостатических и цитотоксических эффектов этопозида в ЭСК и ЭТ разных стадий дифференцировки выявило существенные различия в чувствительности к цито-статику между ЭСК и ЭТ, а так
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.