БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2011, том 28, № 1, с. 52-59
УДК 615.451.2
ЦИТОТОКСИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ ДИГИДРОКВЕРЦЕТИНА И ЕГО ПРОИЗВОДНЫХ В ЛИПОСОМНОЙ ФОРМЕ И В ВИДЕ ЖИРОВОЙ
НАНОДИСПЕРСНОЙ ЭМУЛЬСИИ
© 2011 г. Р. С. Фадеев1, 4, В. В. Капцов2, А. А. Уминский3, В. С. Акатов1, 4
Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290, Пущино, Московская обл.
2Институт биофизики клетки РАН, 142290, Пущино, Московская обл.
3Институт приборостроения РАН, 142290, Пущино, Московская обл.
4Пущинский государственный университет, 142290, Пущино, Московская обл.
Поступила в редакцию 01.06.2010 г.
После доработки 01.09.2010 г.
Исследовали токсическое действие на опухолевые клетки in vitro дигидрокверцетина (ДГК) и его производных пента-О-ацетилсалицилат дигидрокверецина (ПАС ДГК), пента-О-ацетат дигидрокверцетина (ПА ДГК) и пента-О-бензоат дигидрокверцетина (ПБ ДГК) в водных растворах, а также в липосомной форме и в виде нанодисперсных жировых эмульсий. Обнаружено, что производные ДГК значительно хуже растворяются в водных растворах, чем сам ДГК. Модификация ДГК либо не изменяла его токсичность (ПАС ДГК), либо значительно уменьшала ее (ПА ДГК, ПБ ДГК). ДГК в водном растворе был более токсичен, чем в липосомах. ДГК в форме жировой эмульсии так же, как ДГК в растворе, оказывал более сильное цитотоксическое действие, чем в липосомной форме. Полученные результаты могут быть полезны для разработки новых противоопухолевых препаратов на основе липосомных и жировых эмульсий, а также для разработки липосомных препаратов ДГК и его производных.
Ключевые слова: липосомы, жировые эмульсии, дигидрокверцетин, опухолевые клетки, цитоток-сичность.
Флавоноиды или биофлавоноиды составляют обширную группу природных соединений. Наиболее известными представителями этой группы являются рутин, кверцетин, дигидрокверцетин (ДГК) и их производные. Кверцетин (3,3,4,5,7-пентагидроксифлавон) обнаружен во многих овощах и фруктах, а также в красном вине. Дигидрокверцетин (таксифолин) содержится в большом количестве в смоле сибирской лиственницы [1]. Считается, что кверцетин оказывает противоопухолевое действие, подавляет размножение многих опухолевых клеток in vitro, ингибирует гликолиз, активность ряда ферментов и синтез макромолекул, в частности белков теплового шока HSP70, и обладает антиоксидантной активностью [2—8]. По биологическому действию дигидрокверцетин сходен с кверцетином, но превосходит его по активности. Клинические испытания кверцетина затруднены из-за его слабой растворимости в водных растворах, а использование в качестве растворителя диметисульфоксида (ДМСО) может сопровождаться гепато- и нефро-токсичностью [9]. Для эффективной доставки различных лекарств (противомикробных, фунги-цидных, химиотерапевтических) к их мишеням предлагается использование липосом [10, 11].
Липосомы как носители противоопухолевых препаратов могут ослаблять побочные токсические эффекты лекарств на организм, например, антра-циклин-индуцированную кардиомиопатию [12]. Это может быть связано с тем, что липосомы способны накапливаться в опухолях вследствие того, что капилляры опухолей значительно фенестри-рованы из-за ускоренного и дефектного ангиоге-неза [13]. В настоящее время проводятся работы по модификации липосом для улучшения их адресной доставки — например, с использованием антител, а также для повышения иммунотоле-рантности организма к липосомам за счет их покрытия полиэтиленгликолем. Учитывая преимущества, связанные с применением липосом, рядом исследователей предлагается использование кверцетина в липосомной форме [14, 15]. Это же относится и к дигидрокверцетину, хотя он обладает большей растворимостью в водных растворах, чем кверцетин. Следует также отметить работы по модификации кверцетина и дигидроквер-цетина, направленные на повышение растворимости в физиологических растворах, на усиление их биологических эффектов, на совмещение разных эффектов в одном препарате, например противовоспалительного и антиокси-
дантного действия [16]. В таких случаях возникает необходимость сравнительного изучения биологических эффектов этих соединений.
В настоящей работе выполнено сравнительное исследование токсического действия на опухолевые клетки in vitro дигидрокверцетина (ДГК) и его производных пента-О-ацетилсалицилат дигидро-кверецина (ПАС ДГК), пента-О-ацетат дигидрокверцетина (ПА ДГК), пента-О-бензоат дигидрокверцетина (ПБ ДГК) в водных растворах, а также в липосомной форме и в виде нанодисперсных жировых эмульсий.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Вещества. Дигидрокверцетин (ДГК) и его производные пента-О-ацетилсалицилат дигидрокверцетина (ПАС ДГК), пента-О-ацетат дигидрокверцетина (ПА ДГК), пента-О-бензоат дигидрокверцетина (ПБ ДГК) изготовлены в ИБП РАН (Пущино, Россия). ДГК, ПАС ДГК, ПА ДГК и ПБ ДГК растворяли в ДМСО в концентрации 1 М с последующим добавлением в культуральную среду. Культуральные среды получены из Sigma (США), эмбриональная сыворотка из Invitrogen (США), культуральная посуда закуплена в Nunc (Дания).
Получение липосом и жировых эмульсий. Липо-сомы и эмульсии оливкового масла с различной концентрацией ДГК и ПАС ДГК изготавливали методом экструзии на гомогенизаторе высокого давления "Донор-1" (ИБК РАН, Пущино, Россия). Для приготовления липосом 5 г фосфолипи-дов Lipoid E-80 (Lipoid GmbH, Германия) растворяли в 95 мл дистиллированной воды в условиях постоянного перемешивания с помощью магнитной мешалки. Затем водную эмульсию образовавшихся при перемешивании крупных ламеллярных структур обрабатывали в гомогенизаторе "Донор-1" при давлении 80— 90 МПа в течение 5 мин до получения малых мультиламеллярных липосом (ММЛ) со средним диаметром около 100 нм. Контрольный образец (10 мл) не содержал ДГК. В полученную эмульсию ММЛ, не прерывая процесса гомогенизации, медленно добавляли раствор ДГК в этиловом спирте (по каплям в течение 5 мин) до концентрации ДГК 0.3 мг/мл (0.03 г/100 мл эмульсии), с последующим отбором образца суспензии липосом с этой концентрацией ДГК (10 мл). Затем добавляли раствор ДГК в этиловом спирте с конечной концентрацией ДГК, равной 1 мг/мл (0.1 г/100 мл эмульсии) и 3 мг/мл (0.3 г/100 мл эмульсии). По мере повышения концентрации ДГК происходило увеличение размеров липосом. Конечная концентрация спирта в эмульсии липосом не превышала 5%. Для получения липосом, включающих ПАС ДГК, применяли аналогичный подход, но в качестве раствори-
теля для флавоноида использовали диметилсуль-фоксид.
Стерилизациию эмульсии липосом выполняли в автоклаве ВК-75 (Россия) при давлении пара 1.5 атм в течение 30 мин. Средний диаметр липо-сом контролировали до и после стерилизации.
Приготовление жировой эмульсии оливкового масла с ДГК или ПАС ДГК отличалось от представленной выше методики небольшим уменьшением давления гомогенизации до 70—80 МПа (700—800 кг/см2). Сначала в 95 мл дистиллированной воды добавляли 5 г фосфолипидов Lipoid E-80 и с помощью перемешивания на магнитной мешалке делали водную эмульсию крупных ламеллярных структур. Полученные крупные ла-меллярные структуры медленно добавляли к 5 мл оливкового масла в течение 5 мин в ходе обработки на гомогенизаторе "Донор-1" при давлении 70—80 МПа, после чего в жировую эмульсию, не прерывая процесса гомогенизации, в течение 5—7 мин добавляли растворы ДГК в этиловом спирте или ПАС ДГК в ДМСО. В результате получали жировую эмульсию оливкового масла нанодис-персного размера, содержащую ДГК или ПАС ДГК. Жировую эмульсию стерилизовали так же, как липосомы.
Наличие наночастиц эмульсии или липосом, а также их вид определяли посредством электронного микроскопа JEM 100B (Япония). Препараты для электронной микроскопии были приготовлены методом теневого контрастирования уранил-ацетатом.
На каждом этапе приготовления липосомной и жировой эмульсий контролировали средний размер частиц на приборе Beckman-Coulter N5 (США).
Культура клеток. Для определения цитоток-сичности использовали клетки промиелоцитар-ной лейкемии человека линии HL-60 и клетки эпидермоидной карциномы гортани человека линии НЕр-2, полученные из Всероссийской коллекции клеточных культур (Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург). Клетки HL-60 выращивали в среде RPMI-1640 с добавлением 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота и 50 мкг/мл гентамицина при температуре 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% СО2. Клетки НЕр-2 выращивали в среде DMEM с теми же добавками в тех же условиях.
Анализ цитотоксичности. Для анализа цито-токсичности клетки высевали в 96-луночные культуральные планшеты по 5000 клеток в 100 мкл полной ростовой среды на лунку. Через сутки добавляли по 10 мкл/лунку растворы исследуемых веществ в RPMI-1640 (для HL-60) или в DMEM (для клеток НЕр-2) либо липосомную или жировую эмульсию, и еще через 2 сут подсчитывали число живых и погибших клеток в каждой
Концентрация флавоноидов, мкМ
Рис. 1. Концентрационная зависимость токсического действия ДГК и его производных ПАС ДГК, ПА ДГК и ПБ ДГ на клетки промиелоцитарной лейкемии человека линии HL-60 in vitro. Различие между данными для ДГК и ПАС ДГК недостоверно (р > 0.05), для ДГК и ПА ДГК или ПБ ДГК - достоверно (p < 0.025).
лунке. Для подсчета клеток HL-60 в суспензии применяли камеру Горяева. Жизнеспособность клеток оценивали по включению витального красителя трипанового синего. Для оценки количества клеток НЕр-2 прикрепленные клетки фиксировали и окрашивали кристаллическим фиолетовым в 20% растворе этанола [17]. В качестве показателя цитотоксичности использовали количество клеток через 48 ч после добавления исследуемого вещества, выраженное в процентах к количеству клеток в контрольных (необработанных) культурах. Полученные результаты представлены как среднее ± стандартная ошибка (M ± SEM). Эксперименты проводили не менее чем в четырех повторах (n > 4). Для оценки достоверности различий цитотоксических эффектов различных агентов (флавоноидов в водном растворе, в липосомной форме и в форме жировой эмульсии) были использованы методы Стьюден-та и Уилкоксона.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Цитотоксическое действие ДГК, ПАС ДГК, ПБ ДГК и ПА ДГК в растворе. На рис. 1 приведены
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.