БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ. 1995, том 21. Л5 I, с. 24 - 27
УДК 577. 152 344.02
ТВЕРДОФАЗНЫЕ ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ РЕАКЦИИ
V*. СРАВНЕНИЕ КАТАЛИТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ СУБТИЛИЗИНА И а-ХИМОТРИПСИНА В ОТСУТСТВИЕ РАСТВОРИТЕЛЯ
© 1995 г. Е. Ю. Максарева, Ю. И. Хургин
Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН, Москва, 1179!3.Ленинский пр-т, 47
Поступила в редакцию 11.02.94 г.
Показана способность субтилизина Саг1$Ьег§ (КФ 3.4.21.14) гидролизовать п-нитроанилид >4-сукци-нил-/.-фенилалйнииа в твердой фазе в отсутствие растворителя. Для реализации этого процесса необходима определенная степень 1 идратации белка, достигаемая при относительном давлении паров воды (р/р$) не ниже критического значения 0.49. Максимальное превращение субстрата происходит при 0.92. Такая же зависимость от гидратации наблюдается и для твердофазной инактивации субтилизина бензнлеульфонилфторидом. Закономерности протекания твердофазных реакций сс-химотрипсина и субтилизина, принадлежащих к разным семействам сериновых протеиназ, практически одинаковы.
Ключевые слова; субтилиэин, а-химотрипсин. ферментативные реакции твердофазные
Ранее нами была обнаружена способность а-химотрипсина (далее - химотринсина) осуществлять катализ реакции гидролизапизкомолеку-лярных субстратов в твердой фазе 12]. Изученные твердофазные ферментативные реакции протекают в отсутствие воды как растворителя, но требуют наличия определенной степени гидратации бетка. Установленные экспериментально характерные особенности протекания твердофазных реакций связаны с гидратационными свойствами поверхности белковой глобулы [3]. Следует отметить, что количество связанной белками воды (Я, моль/моль) однозначно задается величиной относительного давления водяных паров р/ру
Реакция твердофазного гидролиза с участием химотриисина протекает по ферментативному механизму; в расчете на один активный центр может осуществляться большое число оборотов [4]. Локально связанная в активном центре молекула воды выполняет роль одного из субстратов катализируемой реакции, а адсорбированная на поверхности вода участвует в формировании каталитически активной пространственной структуры молекулы белка, в том числе в области активного центра [3].
Приготовленные рля исследования твердофазных реакций лиофилизоьанные препараты смеси
^Сообщение IV см. ¡¡]. Сокращении: УРРМЛ - л-нитроаии-лид М-сукцииид-£.-фемилаланина, РМЭР - Псгшнлсульфо-нилфторю, ОМЯО - диметилсульфоксид.
фермент-субстрат не претерпевают изменений при низком давлении паров воды (р!р$ < 0.4) [2]. В этих условиях происходит связывание молекул воды локальными, пространственно разделенными полярными центрами поверхности глобулы [5]. При определенном (так называемом критическом) давлении паров воды р*/р5 = 0.44 - 0.48 происходит фазовый переход, который сопровождается включением каталитической активности фермента; было установлено, что в этих условиях начинается формирование непрерывных цепочек, включающих Н-связанные молекулы воды и локальные полярные центры на поверхности глобулы [6]. Именно в этом узком интервале степени гидратации наблюдалась активация химотрипеп-нп в реакциях гидролиза ЗРРИА [2], необратимая инактивация фермента РМ5Р [5] и гидролиз ацильных производных фермента по остатку активного центра 5ег!95 (циннамоил- и индолил-акрилоилхимотрипсин) Ц, 7]. В настоящей работе изучены проходящие в твердой фазе с участием субтилизина СагкЬе^ (КФ 3.4.21.14) реакции гидролиза БРРНА и инактивации фермента РМБР.
Субтилизин и химотрипсин принадлежат к разным семействам сериновых протеиназ и принципиально различаются как по первичной, так и по пространственной структуре и топографии поверхности глобулы. Оба фермента в растворе инактивируются РМ8Р [8]. Субтилизин, как и химотрипсин, катализирует гидролиз различных эфирных и амидпых субстратов [9], причем хими-
ТВЕРДОФАЗНЫЕ ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ РЕАКЦИИ
25
ческие механизмы катализа обоими ферментами, так же как и принцип организации структуры активного центра, практически совпадают [10]. Это дает возможность провести сравнение степени гидратации, необходимой для формирования каталитической активной ко «формаций химотрии-сина и субтилизина.
Предварительные опыты в твердой фазе в отсутствие воды как растворителя показали, что субтилизин, как и химотрипсин, проявляет каталитическую активность при достижении некоторых значений р!р%.
1. Твердофазный гидролиз SPPNA
Анализ продуктов реакции субтилизина с SPPNA проводился в условиях, разработанных ранее для химотрипсина [2J. При использовании химот-рипсина [2] и субтилизина в твердой фазе (рис. 1) увеличение времени экспозиции фермента с субстратом не приводило к увеличению выхода п-нит-роанилина при всех значениях p/ps (кривые 1 - 3). Субтшшзин, как и химотрипсин, оказался неактивным при низкой гидратации препарата (p/ps < 0.4). Резкое увеличение предельного выхода продукта реакции с ростом р!р% наблюдалось выше определенного критического значения p*/ps, которое получали экстраполяцией прямолинейной части кривых до пересечения с осью абсцисс (рис. 1). Для субтилизина p*/ps = 0.49 ± 0.02, что практически совпадает с р*/р„ для химотрипсина (0.48 ± 0.02) [2]. Наклоны кривых для двух ферментов несколько различались; максимальный выход реакции L4„,.u) в опытах с химотрипсином достигался при p/p.t = 0.75, в то время как с субтилизином -при более высоком значенииp/ps (0.92). Значение p/p,,, при котором достигался максимальный выход (A/Amax ~ 1) (рис. 1), было практически одинаковым для смесей с молярным соотношением субтилизина и SPPNA ] : 2 и 1 : 6. Следовательно, в твердой фазе каждый активный центр субтилизина способен осуществлять несколько оборотов. Это указывает на ферментативный характер данной твердофазной реакции.
р*/рs
Рис. 1. Зависимость выхода я-нитроанилина, образующегося в результате гидролиза SPPNA в смеси с химотрипсином (/) или субтилизином (2, J), от относительного давления паров воды (p/ps) над препаратом при длительности опытов 150 (/), 350 (2) и 700 ч („■?). Дтах - выходы n-нитроанилина при p/ps 0.92.
{, отн. ед.
2. Инактивация субтилизина в твердой фазе
Как и гидролиз SPPNA, инактивация субтилизина PMSF (рис. 2) требует определенной степени гидратации. Необратимая модификация остатков Ser 195 активный центров была ранее использована для количественного определения содержания активного химотрипсина в твердой фазе в зависимости отр/р% [5]. Было показано, что в препарате химотрипсина имеется распределение молекул фермента по степени гидратации, необходимой для включения каталитической активности. По мере роста влажности выше р*!р% происходит переход все большего количества молекул фермен-
Рис. 2, Зависимость степени инактивации I (в отн. ед.) химотрипсина (7) и субтилизина (2) в твердой смеси с РМЭР от относительного давления паров воды над препаратом. Длительность опытов 350 ч.
та в активное состояние. Поэтому изотермы твердофазных реакций (рис. 2) характеризуют распределение молекул химотрипсина и субтилизина по степени их "подготовленности" к включению активности при разных р/р$ [5].
Как видно из рис. 2, при инактивации химотрипсин и субтилизин обнаруживают точку фазового перехода в одной и той же области р/рк:
26
МАКСАРЕВА, ХУРГИН
критические значения р*!р,, составляют 0.44 ± 0.03 (г = 0.94) для химотрипсина [5] и 0.48 ± 0.03 {г = 0.95) для субтилизина.
Максимальная глубина инактивации в обоих случаях не превышала 75%. Неполнота ингиби-рования, вероятно, объясняется наличием неактивной доли фермента в растворе при тех значениях рН, которые использовались нами при приготовлении препаратов [5J,
Наряду с критической точкой перехода в активное состояние гидратационно-зависимые процессы характеризуются наклоном линейного участка изотермы гидролиза при p/ps > p*!ps. Соответствующие величины для двух сопоставляемых протеиназ заметно различаются (рис. 1, 2). Для достижения одного и того же уровня инактивации требуется меньшая гидратация субтилизина по сравнению с химотрипсипом (рис. 2). В то же время определенный предельный выход п-нитроани-лина при гидролизе SPPNA в случае субтилизина достигается при больших значениях р/'р% (рис. 1). Полученные к настоящему времени данные в первом приближении можно объяснить несколько более прочным удерживанием ингибитора и субстрата, а также продуктов гидролиза в активном центре субтилизина. Это должно способствовать стабилизации комплекса фермент субстрат. Одновременно может затрудняться продуктивное связывание молекулы воды на стадии дезацилиро-вания, а также диссоциация продуктов в твердой фазе.
Полученные результаты показывают, что ферментативная активность в твердой фазе не является уникальным свойством химотрипсина, а проявляется также и в случае субтилизина. Необходимо отметить, что субтилизин, как и химо-грипсин, в твердой фазе начинает проявлять каталитическую активность в том же самом интервале р/р% (p*/ps = 0.45 - 0.50).
Одинаковый характер воздействия воды на функциональные свойства двух белков с различной третичной Структурой согласуется с обнаруженной ранее общностью гидратационных свойств водорастворимых глобулярных белков [3]. Емкость эффективного монослоя воды на поверхности белковой глобулы, которая соответствует общему числу первичных центров гидратации, для большого числа водорастворимых глобулярных белков является постоянной величиной (0.056 ± 0.003 г Н20 на 1 г белка) [3, 11]. Следовательно, можно предполагать, что фазовый переход в области p/ps = 0.45 - 0.50, который сопровождается включением функциональной активности химотрипсина и субтилизина, происходит при одинаковой степени гидратации обоих белков, в 1.8 раза превышающей емкость эффективного монослоя.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Использовали субтилизин (Boehringer), бен-зилсулъфонилфторид (Serva), «-нитроанилид Щ-сукцинил-£-фенилалатща ("Реахим").
Концентрацию белка (С, мг/мл) определяли спектрофотометр» чески, используя значение 1 %
£280 = 9.6 [8]. Содержание активного субтилизина определяли по [ 12], применяя в качестве титрапта циннамоилимидазол.
Активность субтилизина в единицах ВТМЕ (а) измеряли по скорости ги
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.