БИОФИЗИКА, 2010, том 55, вып.6, с.1076-1082
== БИОФИЗИКА КЛЕТКИ= =
УДК 576.32.03:582.24
УЧАСТИЕ ЭКСТРАКЛЕТОЧНОЙ цАМФ-СПЕЦИФИЧНОЙ ФОСФОДИЭСТЕРАЗЫ В РЕГУЛЯЦИИ ДВИГАТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ПЛАЗМОДИЯ РкуБагит ро1уеерШит
© 2010 г. Н.Б. Матвеева, М.А. Морозов, А.Р. Незвецкий, Т.Г. Орлова,
В.А. Теплов, С.И. Бейлина
Учреждение Российской академии наук Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН,
142290, Пущино Московской области Поступила в p едакцию 17.08.10 г.
На плазмодии РЪутгит роЬусвркаЬит - многоядерной амебоидной клетке с автоколебательным характер ом подвижности - исследована возможность вовлечения экстр аклеточной цАМФ-спе-цифичной фосфодиэстеразы в управление двигательным поведением. Показано, что скорость гидролиза 10 мМ цАМФ частично очищенным препаратом фосфодиэстеразы, секретируемой плазмодием в ходе миграции, уменьшается в 20-30 раз в присутствии 1 мМ дитиотреитола. В концентр ациях 1-5 мМ этот восстанавливающий агент задерживает начало распластывания и пер еход плазмодия в фазу мигр ации. Длительность задержки пропор циональна концентрации ингибитор а. В соответствии с морфологической кар тиной, дитиотреитол увеличивает длительность сохранения относительно высокочастотных автоколебаний сократительной активности, в норме предшествующих увеличению скорости распластывания и характерных также для реакции плазмодия на аппликацию аттрактантов в пространственно однородной концентрации. Полученные результаты свидетельствуют о том, что аутокринная продукция цАМФ и экстр аклеточной цАМФ-специфичной фосфодиэстеразы является важной составляющей механизма, контролирующего двигательное поведение плазмодия РЬуттит роЬусвркаЫт.
Ключевые слова: амебоидное движение, автоколебания, аутокринные сигналы, цАМФ-специфичная экстраклеточная фосфодиэстераза, плазмодий Ркуттит роЬусвркаЬит.
Двигательное поведение амеб и тканевых клеток в отсутствие внешних ориентирующих сигналов (автономная двигательная активность) исследовано в значительно меньшей степени, чем таксисы клеток в градиентах химических и физических стимулов. Вместе с тем, как показано на культивируемых фибробластах [1] и плазмодии миксомицета Рку8агит роЬусвркаЬит [2,3], такое поведение имеет регулярный хар актер и реализуется по определенному сценарию. Первой фазой автономной двигательной программы является изотропное распластывание с формированием лидирующего края на периферии клетки, второй - мигр ация в поляризованной форме с периодическим чередованием перемещения фронта и подтягивания хвоста [3]. В отличие от фибробластов, где такие изменения фор мы связаны с активностью ламеллы, в плазмодии Рку8агит роЬусвркаЬит они относятся к протоплазме в целом.
Сокращения: цАМФ - циклический 3',5'-аденозинмоно-фосфат, эФДЭ - экстраклеточная цАМФ-специфичная фосфодиэстераза циклических нуклеотидов, ДТТ - дитио-треитол.
Плазмодий миксомицета Pкysarum роЬусвр-каЬит представляет собой многоядерную клетку с характерной для амеб дифференциацией протоплазмы на относительно стационар ную геле-образную эктоплазму и золеобразную эндоплазму, текущую по пронизывающим эктоплазму каналам и эктоплазматическим трубкам (тяжам или венам). П р и распластывании и мигр ации древовидная сеть каналов, пронизывающих пленку эктоплазмы вблизи лидирующего края (фр онта), тр ансформир уется в сеть тяжей, уже не связанных общей пленкой. П ри мигр ации плазмодия по мере отдаления от фронта сеть тяжей вырождается до единственного хвостового тяжа. Напр авление и скоро сть потока эндоплазмы, так же как величина силы, генер и-руемой эктоплазмой, меняются в автоколебательном режиме с периодом, варьирующим в зависимости от функционального со стояния плазмодия от 1 до 5 минут [4]. Распластывание, миграцию и таксисы плазмодия определяет результирующий перенос эндоплазмы в сторону лидирующего края.
Двигательная активность плазмодия стимулируется истощением питательного субстрата,
и для нахождения нового источника пищи (в ближайшей периферии при распластывании и на большем отдалении при миграции в полярной форме) программа его двигательного поведения пр едставляется оптимальной. Плазмодий избегает уже «обследованных» участков субстрата, что легко видеть по следу слизи, остающемуся на подложке. Это, а также динамика частот сократительной активности при распластывании, позволяет предполагать, что автономная двигательная программа плазмодия регулируется продуктами, выделяемыми им во внешнюю среду [2].
В настоящей работе в качестве потенциальных регуляторов этой программы рассматриваются циклический 3',5'-аденозинмонофосфат (цАМ Ф) и (цАМФ )-специфичная экстраклеточная фосфодиэстераза (эФДЭ). Экстр аклеточная фосфодиэстэраза циклических нуклеотидов впервые была обнаружена как продукт, секре-тируемый микроплазмодиями РНу8агыш ро1усер-НаЫт в ростовую среду [5,6], где его функция остается неизвестной. Как мы показали, фермент продуцируется также голодающим плазмодием, мигрирующим по агаровой подложке. Была разр аботана процедур а его выделения из таких подложек и частичной очистки, определена молекулярная масса и продемонстрирована специфичность фермента по отношению к цАМФ [7]. X арактерными свойствами фермента являются аномально высокая по сравнению с внутриклеточными фосфодиэстеразами термостабильность, сохранение активности в 1%-м додецилсульфате натрия и дезактивации в присутствии Р-меркаптоэтанола [7]. Для плазмодия Рку8атт ро1усерНа1ыт показан также положительный таксис в градиенте нескольких ингибиторов цАМ Ф-фосфодиэстераз [8]. Эти данные безусловно представляют интерес, однако не являются достаточными для утверждения об экстраклеточном хар актере регуляции, поскольку использованные авторами ингибиторы являются проникающими и мишенью их действия могут быть как экстра-, так и внутриклеточные фосфодиэстеразы.
Учитывая уже показанную чувствительность эФДЭ плазмодия к восстанавливающим агентам [7], в настоящей работе мы использовали дитиотреитол (ДТТ), агент, способный изменить активность эФДЭ, но не строго контролируемый окислительно-восстановительный статус цитоплазмы. И сследован хар актер действия ДТТ на ферментативную активность препаратов эФДЭ Physarыm ро1усерка1ыт, двигательное поведение и автоколебательный режим плазмодия.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Культивирование плазмодия. Physarum poly-cephalum, штамм ВКМ(F) 3283 культивировали по методу [9] в виде суспензии микроплазмодиев. Макроплазмодии, полученные в результате слияния микроплазмодиев, выр ащивали в поверхностной культуре по модифицированному методу [10] на подложке из 2% агарового геля с подкормкой овсяными хлопьями.
Получение препаратов экстраклеточной цАМФ-специфичной фосфодиэстеразы и измерение их ферментативной активности. П репа раты частично очищенной эФДЭ получали по методу, детально описанному ранее [7]. Ферментативную активность препаратов измеряли, определяя скорость гидролиза 10 мМ цАМФ в среде, содержащей 20 мМ HEPES-NaOH, рН 8,0 и 1 мМ Mgd2. Ряд проб дополнительно содержал ДТТ в концентрации 0,1-1 мМ. Реакции инициировали добавлением препаратов эФДЭ и вели в течение 15-30 мин. Для разделения субстрата цАМФ и продукта реакции (5'AMФ) использовали метод тонкослойной хроматографии на селикагелевых пластинах Kieselgel 60F254 (Merck, Германия) в смеси изопропанол : аммиак : вода в соотношениях 7:1:2 (об./об.), как описано ранее [7].
Автоколебания сократительной активности плазмодия регистрировали модифицированным оптическим методом [11], как локальные колебания толщины и пульсирующие перемещения края клетки. Экспериментальную камеру с плазмодием, помещенным на прозрачную подложку из агарового геля, фиксировали на столике микроскопа МПС 1, освещали снизу физиологически неактивным красным светом [12] и помещали так, чтобы изображение выбранного участка клетки проецировалось на отверстие в маске, установленной в фокальной плоскости микроскопа МПС-1. Для освещения использовали сверхъяркий светодиод ЬХНЬ-ЬБ3С (Phi-^s Limited, Голландия), преимуществом которого является отсутствие инфракрасной составляющей и, как следствие, нагревания объекта. Установка позволяла одновременно регистрировать световой поток через два отверстия в маске, затеняющей фокальную плоскость, менять расстояние между участками регистр ации и визуально оценивать состояние объекта. Световой поток через каждое из отверстий регистр ир овался собственным фотоприемником, сигналы с фотоприемников, оцифрованные с помощью АСП, передавались в компьютер.
Двигательное поведение плазмодия оценивали с использованием двух типов образцов: регенерирующих протоплазматических капель,
(а) (б)
Рис. 1. Морфологическая картина двигательного поведения плазмодия в контроле и на подложках, содержащих ДТТ. Концентрация ДТТ указана слева. Изображения соответствуют 4-му (а) и 5-му (б) часу после помещения образцов на соответствующие подложки. Масштабный отрезок - 1 см.
получаемых при проколах крупных тяжей, и круглых фрагментов фронтальной пленки. Для получения последних плазмодию позволяли мигрировать поверх вырезанных с помощью стального пробойника кружков фильтровальной бумаги диаметром 4 мм, которые предварительно раскладывали перед фронтальной зоной. Затем образцы изолировали, подрезая гладкую фронтальную пленку с помощью пробойника, и переносили вместе с бумажной подложкой на 1,5 мм слой 1,5% агара, содер жащего 10 мМ HEPES, рН 7,0, с добавкой ДТТ или без. Результаты наблюдений документировали в виде цифровых изображений с помощью сканера Astra 6700 UMAX (Англия).
В работе использовали: агар (Difco, США), дитиотреитол (DIAM, Гер мания), гемин, HEPES, Sigma (США), глюкозу и соли для приготовления культуральных сред квалификации чда и о сч «Реахим» (Россия). Дитиотр еитол растворяли в дистиллированной воде до концентрации 100 мМ. Для введения в агаровую подложку аликвоты стокового раствора вносили в расплавленный и охлажденный до 50-60°С 1,5% агар. Учитывая способность ДТТ к окислению, использовали только свежеприготовленные раствор ы.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Ферментативная активность экстраклеточной цАМФ-специфичной фосфодиэстеразы. Результаты исследования влияния дит
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.