ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2011, том 58, № 4, с. 509-517
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.1
УЧАСТИЕ ДИССИПАТИВНЫХ СИСТЕМ В КОНТРОЛЕ ЭНЕРГЕТИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ ДЫХАНИЯ В МИТОХОНДРИЯХ ЭТИОЛИРОВАННЫХ ПРОРОСТКОВ ОЗИМОЙ ПШЕНИЦЫ © 2011 г. Й. Р. Абдрахимова*, И. М. Андреев**, А. Г. Шугаев**
*Биолого-почвенный факультет Казанского федерального (Приволжского) университета, Казань **Учреждение Российской академии наук Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Москва
Поступила в редакцию 13.10.2010 г.
Исследовано влияние цианид-резистентной альтернативной оксидазы (АО) и модуляторов активности разобщающих белков (PUMP) на скорость дыхания и генерацию трансмембранного электрического потенциала (Ау) при окислении различных субстратов митохондриями этиолированных проростков озимой пшеницы (Triticum aestivum L.). Митохондрии пшеницы характеризовались достаточно высокой эффективностью процесса окислительного фосфорилирования при окислении малата и сукцината (высокими значениями ДК по Чансу, отношения АДФ/О и скорости синтеза АТФ), которая однако в значительной степени модулировалась активностью диссипативных систем. С использованием сафранина выявлено частичное рассеивание Ау при действии ингибиторов цитохромного пути (цианида, антимицина А) на окисление малата и наличие компенсаторного механизма по его поддержанию при функционировании АО. Установлена превалирующая роль комплекса I электрон-транспортной цепи в поддержании Ау и синтеза АТФ при функционировании АО на фоне ингибирования переноса электронов по цитохромному пути. Изучено влияние активатора PUMP — линолевой кислоты (ЛК) в физиологически низких концентрациях (4—10 цМ) на дыхание и генерацию Ау митохондриями. Показано, что разобщающий эффект ЛК, который выявлялся по активации дыхания в состоянии 4 и рассеиванию Ау, снимался БСА, но не пуриновыми нуклеотидами. Обнаружено также, что разобщающее действие ЛК сопровождалось обратимым подавлением активности АО. Полученные результаты обсуждаются исходя из возможной физиологической роли энерго-диссипативных систем митохондрий в регуляции процесса запасания энергии в растительных клетках в стрессовых условиях.
Ключевые слова: Triticum aestivum — митохондрии — мембранный потенциал — субстраты окисления — ингибиторы дыхания — линолевая кислота
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время отмечается повышение интереса к изучению энерго-диссипативных систем митохондрий растений, функционирование которых снижает энергетическую эффективность процесса окислительного фосфорилирования путем рассеивания в виде тепла части энергии, генерируемой электрон-транспортной цепью (ЭТЦ), как до, так и после преобразования ее в энергию трансмембранного протонного градиента (АцИ+). Наряду с исследованием альтернативных путей
Сокращения: АО — альтернативная оксидаза; ДК — дыхательный контроль; ЛК — линолевая кислота; СГК — салицилгид-роксамовая кислота; СЖК — свободные жирные кислоты; СКФ — скорость фосфорилирования; ЦРД — цианид-резистентное дыхание; Ау — мембранный потенциал; FCCP — карбонилцианид-(п)-трифторметоксифенилгидразон; PUMP — разобщающие белки митохондрий растений. Адрес для корреспонденции: Абдрахимова Йолдыз Раисовна. 420008 Казань, ул. Кремлевская, 18. Казанский федеральный (Приволжский) университет. Факс: 007 (843) 238-71-21; электронная почта: yoldez@mail.ru
переноса электронов, в первую очередь, CN-ре-зистентной оксидазы (АО), шунтирующей два из трех пунктов энергетического сопряжения в ЭТЦ [1, 2], большое внимание уделяется изучению термогенин-подобных разобщающих белков (PUMP), способных существенно увеличить протонную проводимость внутренней мембраны митохондрий и, тем самым, приводить к снижению на ней мембранного потенциала (Ау) [3, 4]. Учитывая широкое распространение АО и PUMP, представляется важным выяснение физиологической роли этих систем в нетермогенных тканях растений. Постулируется, в частности, что дисси-пативные системы функционируют как "мягкие" разобщители, контролируемо снижающие величину Ау и зависящую от нее скорость образования активных форм кислорода (АФК), обладающих токсическим действием на мембраны, белки и другие полимеры клетки и самих митохондрий [5]. Это подтверждается в основном экспериментальными данными о повышении активности
этих систем под влиянием экзогенных АФК, а также в условиях абиотического стресса и сопровождающего его окислительного стресса [2, 3, 6—9]. Кроме того, в последнее время АО отводится важная роль в оптимизации дыхательного метаболизма в ходе роста и развития растений, его интеграции с фотосинтезом и другими важнейшими метаболическими процессами [2, 10, 11]. Вместе с тем, следует отметить, что большинство гипотез, касающихся физиологической роли АО, PUMP и других диссипативных систем в митохондриях растений, нуждается в дополнительной экспериментальной проверке.
Хотя в последние годы достигнуты значительные успехи в молекулярной идентификации рассматриваемых диссипативных систем, идентификации генов, кодирующих соответствующие им белки, а также в выяснении факторов, контролирующих их функциональную активность, многие аспекты их функционирования остаются еще неясными [10, 12]. В частности, открытыми остаются вопросы о том, все ли факторы эндогенной природы, участвующие в активации/инактивации таких систем, выявлены к настоящему времени, и как осуществляется их взаимодействие и координация их функциональных активностей в ходе регуляции энергетической эффективности дыхания митохондрий.
Исследования диссипативных систем в митохондриях растений проводятся в основном на уровне изолированных органелл, и выявление их действия часто осложняется тем обстоятельством, что оно требует оптимизации условий выделения этих органелл и анализа их функциональной активности. В настоящей работе, проведенной на митохондриях, выделенных из этиолированных проростков озимой пшеницы в условиях, которые были тщательно оптимизированы, мы попытались оценить влияние различных диссипативных систем на процесс окислительного фосфорилирования и генерацию мембранного потенциала.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектом исследований служили 3-дневные этиолированные проростки мягкой пшеницы озимой расы (Triticum aestivum L., сорт Мироновская 808), выращенные гидропонным способом на водопроводной воде при комнатной температуре.
Митохондрии выделяли по методу Войникова [13] в нашей модификации. Побеги (колеоптили с зародышевыми листьями) длиной 1.5—2.0 см (15—20 г) предварительно охлаждали, нарезали и растирали в ступке со средой выделения в соотношении не менее 1 : 4 со средой выделения (гомогенизации), содержавшей 0.3 М сахарозу, 18 мМ КН2РО4 (рН 7.9), 1 мМ MgCl2, 5 мМ ЭДТА, 5 мМ
дитиотрейтол (ДДТ) и 0.1% бычий сывороточный альбумин (БСА), свободный от жирных кислот (ЖК). Гомогенат фильтровали через бязь и центрифугировали при 8000 g в течение 5 мин. Для осаждения митохондрий полученный суперна-тант центрифугировали при 20000 g в течение
4 мин. Выделенные митохондрии ресуспендиро-вали в малом объеме среды, содержавшей 0.3 М сахарозу, 18 мМ КН2РО4 (рН 7.2) и 0.1% БСА, свободный от ЖК. Суспензию митохондрий хранили на льду. Все операции проводили в холодной комнате при 4—5°С.
За генерацией Ду следили по изменению разности поглощения при 511 и 533 нм (ДЛ511-533) сафранина О по методу Moore и Bonner [14] на спектрофотометре Hitachi-557 (Япония). Среда инкубации (2 мл) содержала: 0.3 М сахарозу, 18 мМ КН2РО4 (рН 7.2), 1 мМ М§С12, 5 мМ ЭДТА,
5 мкМ сафранин О и 0.2 мг/мл митохондриально-го белка. В большинстве случаев среда инкубации содержала 0.1% БСА, за исключением опытов с активацией PUMP. Активацию PUMP линолевой кислотой (ЛК) проводили в присутствии 10 мкМ олигомицина и 25 мкМ атрактилозида, исключив из состава реакционной среды БСА.
Определение скорости поглощения кислорода митохондриями проводили амперометрически, используя полярограф LP-7 (Чехия) и кислородный электрод [15] при 25°С. Среда инкубации (1 мл) содержала 0.3 М сахарозу, 18 мМ КН2РО4 (рН 7.2), 1 мМ М§С12, 5 мМ ЭДТА, 0.1% БСА, а также оптимальное количество (0.4—0.5 мг) мито-хондриального белка. Скорость дыхания в состоянии 3 и 4, величину отношения АДФ/O, коэффициент дыхательного контроля (ДК) и скорость фосфорилирования (СКФ) рассчитывали согласно Chance и Williams [16]. Для ингибирования основного (цитохромного) дыхания использовали 0.5—2.0 мМ КСМ или 3 мкМ антимицин А, альтернативного (цианид-резистентного) — 3 мМ са-лицилгидроксамовую кислоту (СГК). Содержание митохондриального белка в пробах определяли по методу Lowry c БСА в качестве стандарта.
Каждый опыт проводили в 4—5 биологических и 2—3 аналитических повторностях. На рисунках представлены результаты характерных опытов.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Характеристика функциональной активности изолированных органелл
На рис. 1 приведены типичные полярографические кривые, отражающие кинетику поглощения кислорода митохондриями этиолированных проростков озимой пшеницы при окислении ими малата или сукцината в присутствии глутамата. Можно видеть, что выделенные митохондрии характеризуются достаточно интенсивным дыхани-
(а)
Мх
| Малат 10 мМ + ^^глутамат 10 мМ
№ АДФ
/200 мкМ
ДК = 3.6 АДФ/О = 2.8
36 АДФ 200 мкМ
124 КСМ 2 мМ
СГК
3 мМ
1 мин
(б)
Мх
I Сукцинат 10 мМ + ^ глутамат 10 мМ
АДФ ^/100 мкМ
ДК = 1.5 АДФ/О = 1.8
^68 АДФ ^/100 мкМ
КСК 2 мМ
СГК I68 /3 мМ
Рис. 1. Полярографические кривые поглощения кислорода при окислении малата (а) и сукцината (б) митохондриями, выделенными из этиолированных проростков озимой пшеницы.
Условия измерений описаны в разделе МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Митохондрии (Мх) добавляли в среду (рН 7.2), содержавшую 0.3 М сахарозу, 18 мМ КН2РО4, 1 мМ МgСl2, 5 мМ ЭДТА и 0.1% БСА. Цифры около кривых — скорость поглощения кислорода, нмоль О2/(мг белка мин).
ем, которое существенно стимулируется в присутствии АДФ (состояние 3), а также обнаруживает значительную величину ДК по Чансу, особенно при окислении НАД-зависимых субстратов.
Как следует из данных, приведенных на рис. 1, митохондрии, выделенные из этиолированных проростков, обнаруживали выраженную способность к цианид-резистентному
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.