АГРОХИМИЯ, 2014, № 8, с. 56-62
Регуляторы роста растений
УДК 631.811.982:581.145:631.528
УЧАСТИЕ ЭНДОГЕННЫХ ГИББЕРЕЛЛИНОВ В РЕГУЛЯЦИИ ПЕРЕХОДА К ЦВЕТЕНИЮ МУТАНТОВ Arabidopsis thaliana
© 2014 г. Э.Л. Миляева, В.Н. Ложникова
Институт физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН 127276Москва, ул. Ботаническая,35, Россия E-mail: e_milyaeva@mail.ru
Поступила в редакцию 21.02.2014 г.
Показано участие эндогенных гиббереллинов в регуляции перехода к цветению мутантов Arabidopsis thaliana. Недавно выявлены и клонированы гены, ответственные за переход растения к цветению и показано, что основным геном фотопериодической реакции, определяющей переход растений к цветению, является ген CONSTANS (CO) и его гомологи, например, CONSTANS LIKE 1 (COL 1). В данном опыте были использованы факультативно длиннодневные растения Arabidopsis thaliana расы Columbia дикого типа и два инсерционных мутанта по гену COL 1. Было проведено сравнение темпов роста и скорости перехода к цветению, скорости роста листьев, а также цветков, тычинок, пыльников и пестиков у мутантов и растений дикого типа в условиях длинного дня. Обнаружено, что растения инсерционных мутантов значительно отличались от растений дикого типа по скорости перехода к цветению. Определение активности гиббереллинов в этих растениях также выявили существенные различия. У одного из мутантов, который зацветал гораздо быстрее, чем растения дикого типа, активность гиббереллинов оказалась в 2 раза больше, в то время как у мутанта с задержкой цветения было обнаружено пониженное содержание гиббереллинов. Это свидетельствовало о важной роли гиббереллинов в процессах фотопериодизма, что подтвердило гормональную теорию зацветания растений М.Х. Чайлахяна.
Ключевые слова: мутанты Arabidopsis thaliana L., эндогенные гиббереллины, переход к цветению.
ВВЕДЕНИЕ
Цветение - один из ключевых этапов в развитии растений, обеспечивающий их семенное размножение и определяющий основы урожая большинства сельскохозяйственных культур. Важнейшими регуляторами их онтогенеза, в том числе и перехода к цветению, являются фито-гормоны. Это соединения, с помощью которых осуществляется запуск и смена программ развития, происходит взаимодействие клеток, тканей, органов, необходимых для регуляции физиологических процессов. В работе [1] впервые показали, что для перехода растения к цветению решающее значение имеет их фотопериодическая реакция, т. е. соотношение суточной продолжительности света и темноты. Позже академиком М.Х. Чай-лахяном [2] была выдвинута теория флоригена, постулирующая, что переход растений к цветению происходит под влиянием определенного стимула (флоригена), образующегося в листьях
фотопериодически чувствительных растений на благоприятной для зацветания длине дня и транспортирующегося по флоэме в стеблевые почки. Был сделан вывод о том, что стимул цветения не специфичен для отдельных растительных видов, а имеет общую природу для различных растений. Согласно этой теории, флориген включает 2 комплементарные группы фитогормонов - гибберел-лины и имеющие азотистую природу гипотетические антезины. В условиях длинного дня (ДД) у длиннодневных растений синтезируются собственные эндогенные гиббереллины, а добавление экзогенных почти не влияет на скорость зацветания этих растений, зато в условиях короткого дня (КД) их воздействие вызывает зацветание длиннодневных видов. В работе [3] по влиянию гиббереллинов на переход к цветению длинно-дневного злака ЬоИпт 1етп1еп1пт подтверждена теория М.Х. Чайлахяна и показано, что у этого вида гиббереллины накапливаются в листьях, затем передвигаются в апикальную меристему, где
обнаруживаются спустя несколько часов в условиях ДД и вызывают цветение, т.е. выполняют роль сигнала цветения.
Современное направление изучения регуляции перехода к цветению основано на выявлении конкретных генов, участвующих в этом процессе, их взаимодействия с внешними факторами и друг с другом. Оно проводится на узком круге растительных объектов (Arabidopsis, рис, томат, тыква и др.) и связано с применением молеку-лярно-генетических и генно-инженерных методов. Наиболее изученным в этом отношении является количественно длиннодневное растение Arabidopsis thaliana L., которое представляет собой удобный генетический объект, имеющий короткий жизненный цикл, высокую плодовитость и самоопыляемость. В настоящее время геном этого растения полностью расшифрован. В результате многолетних исследований у Arabidopsis были обнаружены десятки генов, участвующих в регуляции зацветания и в отдельных фазах фло-рального морфогенеза. Были выявлены 4 основных пути регуляции перехода к цветению: фотопериодический путь, который инициируется под влиянием благоприятной для зацветания длины дня, яровизационный (температурный), автономный (возрастной) и гиббереллиновый (индуцированный гиббереллином) [4].
Было показано, что основным геном фотопериодической реакции является ген CONSTANS (CO). Он экспрессируется в клетках листа под влиянием благоприятной длины дня. Продукт гена СО затем индуцирует экспрессию гена FT в клетках-спутниках флоэмы листа или черешка. Продукт экспрессии гена FT - белок ~25 кД перемещается по флоэме в стеблевые почки, где и вызывает переход растений от вегетативного состояния к репродуктивнму [5]. Необходимо отметить, что одним из авторов настоящей статьи в соавторстве еще в 1991 г. с помощью электрофореза был выделен низкомолекулярный белок примерно такой же молекулярной массы (25 кД) в индуцированных ДД листьях и почках длинно-дневного растения рудбекии двуцветной. В то же время этот белок отсутствовал в неиндуцирован-ных листьях и почках этих растений. Это позволило авторам предположить, что обнаруженный белок может быть одним из компонентов флориге-на [6]. В связи с обнаружением этого белка гипотеза М.Х. Чайлахяна о существовании антезинового сигнала получила материальное подтверждение.
Согласно [7], гиббереллин воздействует на ген LEAFY, локализованный в стеблевом апексе, продукты экспрессии которого активируют гены
образования и роста элементов цветков и соцветий. В работе [8] получили данные о том, что гиббереллин необходим для зацветания растений в условиях КД, т. к. мутанты, полностью лишенные биосинтеза этого гормона, не зацветают без обработки экзогенным гиббереллином. Авторами было высказано предположение о 2-х путях зацветания: гиббереллин-независимый в условиях ДД (фотопериодический) и гиббереллин-зависимый, функционирующий в условиях КД.
Таким образом, между двумя концепциями перехода растений к цветению - физиологической и молекулярно-генетической - существуют некоторые несоответствия. Согласно М.Х. Чайлахяну, гиббереллин является неотъемлемым компонентом стимула цветения и связан с фотопериодической индукцией. По представлениям молекулярных генетиков, гиббереллиновый путь является обособленным и не имеет отношения к фотопериодической индукции. Следовательно, вопрос
0 роли гиббереллина в регуляции цветения и его связи с фотопериодической индукцией до конца не ясен.
Цель работы - выяснение роли гиббереллина в зацветании Arabidopsis в связи с фотопериодическим путем зацветания.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектами исследования были факультативно длиннодневные растения Arabidopsis thaliana L. расы Columbia дикого типа и 2 инсерционных мутанта по гомологу гена СО гену CONSTANS-LIKE
1 (COL1). (№ 524856 и № 526182). Семена были получены из банка Nottingham Arabidopsis stock center (Англия).
Мутанты были получены методом вакуумной инфильтрации растений с Agrobacterium tumefaciens, содержащими вектор pROK2. Трансформированный вектор содержал, помимо целевой антисенс-последовательности, ген npt 11 (ген неомицинфосфотрансферазы) под контролем промотера 35 S СаМУ (промотор гена 35 S вируса мозаики цветной капусты). Для отбора жизнеспособных зеленых проростков с хлорофиллом семена мутантов проращивали на агаризованной среде с канамицином в концентрации 100 мг/л.
Наличие вставок в ген COLI, расположенный в 5-й хромосоме, было доказано с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР-реакции). Устойчивые к канамицину растения выращивали в оранжерее Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева в почве и в культуре in vitro
на среде Велиминского-Гихнера в условиях ДД (16 ч света + 8 ч темноты) и КД (8 ч света + 16 ч темноты) при температуре 20-22 °С и освещении люминесцентными лампами белого света ЛБ-80. Интенсивность светового потока на уровне растений составляла 40 Вт/м2.
Для сравнения темпов роста и перехода к цветению мутантов и растений дикого типа на ДД проводили учет скорости роста листьев и цветоносов, времени от появления проростков до образования 1-го бутона, а также числа листьев до зацветания. Изучали также различия в репродуктивных органах, а именно в скорости роста и строении соцветий, цветков и их элементов. Все измерения проводили с помощью микроскопа Carl Zeiss Imager Z-2 с использованием компьютерной программы AxioVision Rel 4.8. Результаты были обработаны статистически с помощью компьютерной программы One Way Anova. Все данные статистически достоверны при Р = 0.95.
Определение свободных форм гиббереллинов в сыром материале проводили после трехкратного экстрагирования 80%-ным этанолом и удаления фенолов с помощью окиси свинца. Материал центрифугировали (6000 об./мин), упаривали на роторном испарителе до воды, надосадочную жидкость подкисляли до рН 3.0, трехкратно переэкстрагировали этилацетатом, вновь упаривали досуха и растворяли в 96%-ном этаноле. Хроматографию проводили в системе изопропил-амми-ак-вода (10 : 1 : 1). Биологическую активность определяли по приросту проростков карликового гороха сорта Пионер. Активность гормонов выражали в эквиваленте А3 [9].
Повторность опытов трехкратная. В каждом варианте опытов использовали в среднем по 10 растений.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Сравнение скорости зацветания изученных мутантов в условиях ДД, определенное по появлению первых бутонов, выявило значительные различия (рис. 1). Мутант 524856 в благоприятных для зацветания условиях ДД зацветал через 7 сут после посева, в то время как растения дикого типа
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.