БИОФИЗИКА, 2014, том 59, вып. 5, с. 933-940
БИОФИЗИКА КЛЕТКИ1
УДК 576.32.03:582.24
УЧАСТИЕ ФОСФАТИДИЛИНОЗИТ-4,5-БИ СФОСФАТСВЯЗЫВАЮЩИ X БЕЛКОВ В ГЕНЕРАЦИИ АВТОКОЛЕБАНИЙ СОКРАТИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ПЛАЗМОДИЯ РкуБагиш ро1усерЬа1иш
© 2014 г. Н.Б. Матвеева, |С.И. Бейлина, А.А. Клюева, В.А. Теплов
Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290, Пущино Московской области, ул. Институтская, 3 E-mail: matveeva@iteb.ru Поступила в p едакцию 01.07.14 г.
На плазмодии миксомицета Physarum рвЬусеркаЫт - гигантской амебоидной клетке с ярко выраженным автоколебательным характером подвижности, имеющей общие со многими тканевыми клетками закономерности двигательного поведения и сигнальные системы, - исследовали возможность участия фосфатидилинозит-4,5-бисфосфата в регуляции сократительной активности. Было изучено действие субстратного ингибитора фосфолипазы C неомицина, с высоким сродством связывающего мембранный фосфатидилинозит-4,5-бисфосфат, на колебания силы, развиваемой плазмодиальными тяжами в изометрическом режиме сокращения, при добавлениях ингибиторов протеинкиназы C, стауроспорина, UCN-01, Ro-318220 отдельно и в комбинации с ингибитором кальмодулина калмидазолием. Показано, что неомицин при рН 7,0 и концентрациях 0,1-5,0 мМ вызывает 10-30-минутное прекращение контрактильных колебаний, но затем они начинают постепенно восстанавливаться, причем их период в начальной стадии восстановления меньше, чем был раньше, и затем увеличивается за счет удлинения фазы сокращения. Анализ полученных данных свидетельствует в пользу предположения, что плазмодиальная мембрана содержит MARCKS-подобные белки и контролирующие протеинкиназу C пулы фосфатидилинозит-4,5-бисфосфата, которые могут участвовать в генерации автоколебаний, наблюдаемых в плазмодии.
Ключевые слова: сократительная активность, автоколебания, фосфатидилинозит-4,5-бисфосфат, протеинкиназа C, фосфолипаза C, MARCKS, плазмодий Physarum polycephalum.
Автоколебания являются существенным атрибутом клеточной подвижности: ни один со -кратительный аппарат не способен обеспечить перемещение клетки на большие расстояния, не работая в колебательном режиме. Несмотр я на большой пр огресс, достигнутый в последние годы в понимании структурных основ амебоидной подвижности, механизм автоколебаний остается во многом неясным. Однако понятно, что период колебаний, лежащий в минутном диапазоне, должен в основном определяться не вязкоупругими параметр ами цитоскелета, а вр е-менными константами химических регулятор-ных цепей от мембранных рецепторов до ак-томиозинового цитоскелета. Одним из существенных компонентов этих цепей является фос-
Cокpащения: PIP2 - фосфатидилинозит-4,5-бисфосфат; IP3 - инозит-1,4,5-трисфосфат; PIP3 - фосфатидилинозит-3,4,5-трисфосфат; PI3K - фосфоинозитид-3-киназа; PTEN -фосфатидилинозит-3-фосфатаза; U73122 - аминостероид -1-(6-((17|3-3-метоксиэстра-1,3,5(10)-триен-17-ил)амино)гексил)-1Н-пиррол-2,5-дион; MARCKS - мембранный субстрат протеинкиназы C.
фатидилинозит-4,5-бисфосфат (Р1Р2), который ответственен за многие клеточные функции, являясь источником трех вторичных мессенжеров: инозит-1,4,5-трисфосфата (1Р3), диацилглицери-на и фосфатидилинозит-3,4,5-трисфосфата (Р1Р3) -продукта фосфорилирования фосфаинозитид-3-киназой (Р13К), а также местом связывания в мембране фосфатидилинозит-3-фосфатазы (РТЕК) и РН-доменов белков, участвующих в регуляции состояния сократительного аппарата [1]. Как субстрат фосфолипазы С, он является ключевым регулятором внутриклеточной концентрации Са2+ [2], опоср едуя различные клеточные события, включая кальциевые осцилляции и волны [3]. Для этих процессов важна концентрация в мембране свободного Р1Р2.
Работами последних лет показано участие в регуляции мембранной концентрации этого фосфолипида Р1Р2-связывающих белков, работающих как обратимые источники свободного Р1Р2 в плазматической мембране [4,5]. Поэтому для понимания механизма генерации автоколебаний важно выяснение механизма регуляции
мембранной концентрации свободного Р1Р2 в амебоидной клетке. Целью работы являлось выяснение этого вопр оса на классическом объекте в изучении амебоидной подвижности -плазмодии миксомицета РНу8агиш ро1усврНа1иш. В этой многоядерной амебоидной клетке, гигантские размеры которой достигаются благодаря разобщению ядерного и клеточного деления, наиболее ярко выражен автоколебательный хар актер подвижности, котор ая имеет общие со многими тканевыми клетками закономерности двигательного поведения [6] и сигнальные системы [7,8]. Амебоидная локомоция играет существенную р оль в процессах заживления ран и метастазирования, иммунитете, эмбриогенезе и морфогенезе.
П ротоплазма плазмодия имеет характер ную для амебоидных клеток структуру с прикрепленной к мембране относительно стационарной гелеобразной эктоплазмой и жидкой текущей эндоплазмой. Мигр ир ующий плазмодий выглядит как веерообразная пленка протоплазмы на фронте, за которой следует сеть тяжей, по виду похожих на сосуды кровеносной системы. Диаметр крупных тяжей может достигать 2 мм, а длина - нескольких сантиметров. Миграция плазмодия происходит за счет результирующего переноса эндоплазмы в сторону лидирующего края по градиенту давления, генерируемом про -странственно хо рошо координированными ритмическими сокращениями актомиозинового ци-тоскелета в эктоплазме. Колебания сократительной активности сопровождаются синхр он-ными колебаниями мембранного потенциала [9,10] и внутриклеточной концентрации Са2+ [11,12], возра стающей до 420 нМ в фазе сокра -щения и снижающейся до 320 нМ в фазе р ас-слабления [13]. В зависимости от функционального состояния плазмодия период автоколебаний может варьировать в диапазоне 1-5 мин [14] и меняется под действием внешних хемо -тактически активных стимулов [15].
Было показано, что в плазмодиальном о с-цилляторе, относительно независимом от внешней концентрации кальция [16] и отвечающего на аттрактанты увеличением частоты автоколебаний и внутриклеточной концентрации Са2+ [17,18], рецепто р 1Р3 является необходимым элементом автоколебательной системы клетки [19]. Нами было также установлено, что ключевым регулятором плазмодиального осциллятора, как и в большинстве эукариотных клеток [2], является фосфолипаза С. С использованием не-омицина как субстр атного ингибитора фосфо-липазы С, который с высоким сродством связывает Р1Р2, образуя электронейтральный комплекс [20], и таким образом блокирует связы-
вание PIP2 c PLC, было показано, что PIP2, регулирующий состояние актина плазмодия [2123], является местом связывания неомицина и основным элементом, связывающим кортикальный цитоскелет плазмодия с мембраной [7]. Аминостероид U73122 (1-(6-((17в-3-метоксиэст-ра-1,3,5(10)-тр иен-17-ил)амино)гексил)-1Н-пиррол-2,5-дион) - ингибитор рецепторной активации фосфолипазы C - пр и отсутствии прямого ин-гибирующего действия на сам фермент [24] модифицировал период осцилляций плазмодия, прерывая передачу рецептир уемого, в том числе и аутокринного сигнала на фосфолипазу C [7,8]. Оба ингибитора подавляли распластывание и миграцию плазмодия. Таким образом, активация фосфолипазы является необходимым условием возбуждения автоколебаний и двигательной реакции плазмодия на сигнальные молекулы, секретируемые самой клеткой [25].
Анализ действия ингибиторов PI3K ворт-маннина и LY294002 на сократительную и двигательную активность плазмодия показал наличие сигнального пути PI3K/PTEN [26]. Полное подавление ответа плазмодиального осциллятор а на аттрактант глюкозу под действием как U733122, эффективно блокирующего активацию рецептора IP3 [8], так и ингибиторов PI3K [26], указывает на наличие положительных обратных связей, необходимых для полной активации обоих сигнальных путей - фосфоли-пазы C и PI3K/PTEN. П ри этом идентичность формы плазмодия - р едукции фр онтальной зоны при использовании U73122 и ингибиторов PI3K, прямо противоположной эффекту удаления фосфатидилинозит-3-фосфатазы на pten-му-тантах Dictyostelium [27], свидетельствует о том, что на плазмодии сигнальные пути фосфоли-пазы C и PI3K/PTEN работают как единый регуляторный механизм. При рецепторной стимуляции осуществляемый фосфолипазой C гидролиз PIP2 снижает его концентрацию в мембране лидирующего края и, тем самым, веро -ятность связывания PTEN, что так же, как активация PI3K, ведет к возрастанию уровня PIP3, связыванию с мембраной дополнительных молекул фосфолипазы C и дальнейшему развитию процесса [8].
В большинстве клеток млекопитающих о с-новным из белков, участвующих в мембранной регуляции PIP2, является мембр анный субстрат протеинкиназы C (MARCKS, Myristoylated Alanine ШсИ C Kinase Substrate), присутствующий в концентр ации, сравнимой с PIP2 (1-10 мкМ) [5]. В покое положительно заряженные эффек-торные домены MARCKS электростатически заякоривают его в мембране. Так как активацию протеинкиназы C при рецепто рной стиму-
ляции фосфолипазы С обеспечивают продукты гидролиза Р1Р2 - диацилглицер ин и 1Р3, вызывающий выход Са2+ из внутриклеточных хранилищ, мембранные пулы Р1Р2, создаваемые МЛИСКБ-подобными белками, мобилизуются при активации рецептора 1Р3, выполняющего важную роль в плазмодиальном осцилляторе [19] и в кальциевых осцилляторах многих клеток [3]. Данный рецептор способен посредством протеинкиназы С и Са2+/кальмодулина поддерживать мембранную концентрацию свободного Р1Р2 и, тем самым, собственную активность.
Наличие обратных связей, регулирующих активность рецепто ра 1Р3, позволяет предполо -жить возможность колебательных изменений уровня Р1Р2. Таким обр азом, на миксомицетах, как и на клетках млекопитающих [1], фосфои-нозитиды, и в первую очередь Р1Р2 и его метаболиты, обладают всеми регулято рными возможностями для осуществления автоколебательного управления динамикой цитоскелета и направленным движением клеток. Для выяснения факта существования в мембране плазмодия локальных депо Р1Р2, динамически регулируемых внутриклеточным Са2+ через протеинки-назу С и/или Са2+/кальмодулин, мы исследовали динамику сократительной активности плазмо-диальных тяжей под действием ингибиторов протеинкиназы С и кал
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.