БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 1, с. 123 - 131
УДК 577.385.5
УЧАСТИЕ ИНТЕГРИНА a2ß1 В МЕХАНИЗМЕ АНОИКИСА КЛЕТОК MCF-7 КАРЦИНОМЫ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ЧЕЛОВЕКА
© 2015 Г.Е. Морозевич1, Н.И. Козлова1, П.А. Каралкин1, О.Ю. Сусова2, А.Е. Берман1*
1 НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН, 119121 Москва, ул. Погодинская, 10; факс:+7(495)708-3806, электронная почта: 1938berman@gmail.com
2 РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, 115478 Москва, Каширское шоссе, 24; факс: +7(499)324-1205, электронная почта: susovaolga@gmail.com
Поступила в редакцию 20.05.14
Блокирование экспрессии интегрина a2ß1 в линии MCF-7 карциномы молочной железы существенно увеличивает чувствительность клеток к субстрат-зависимому апоптозу (аноикису) и резко тормозит их клоно-образующую активность. Торможение экспрессии a2ß1 сопровождается, с одной стороны, увеличением продукции апоптогенного белка p53 и ингибитора циклин-зависимых протеинкиназ — белка p27 и, с другой — уменьшением продукции антиапоптогенного белка Bcl-2 и полифункционального белка cMyc. Снижение в клетках a2ß1 не влияет на активность протеинкиназы Akt, но резко увеличивает активность кина-зы Erk1/2. Торможение последней не влияет на аноикис контрольных клеток, однако снижает до их уровня аноикис клеток с блокированным a2ß1. Полученные результаты впервые свидетельствуют, что интегрин a2ß1 участвует в защите опухолевых клеток от аноикиса через механизм, основанный на ингибировании сигнальной протеинкиназы Erk.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: интегрины, аноикис, опухолевый рост, сигнальные протеинкиназы.
Рост и злокачественная прогрессия опухолевых клеток существенно зависят от их «взаимоотношения» с внеклеточным матриксом (ВНМ). Характерным свойством злокачественного фенотипа является рост клеток в условиях нарушения матрикс-клеточных контактов. В нормальных клетках разрыв связей с матриксом индуцирует стрессовую реакцию, которую они не могут преодолеть и погибают по механизму апоптоза, получившего название субстрат-зависимого апоптоза (аноикиса). Ранней и ключевой стадией опухолевой прогрессии является формирование в клетках механизма, который блокирует аноикис [1—3].
Экспериментальные данные свидетельствует, что ВНМ участвует в регулировании всех этапов онкогенной трансформации. Этот контроль осуществляется с помощью механизма сигна-линга — последовательной передачи сигналов от макромолекул матрикса через цепь посредни-
Принятые сокращения: ВНМ — внеклеточный мат-рикс, мшРНК — малые шпилечные РНК, поли-ГЕМА — полигидроксиметилметакрилат.
* Адресат для корреспонденции.
ков к геному клетки и изменения активности генов. Ключевыми посредниками в указанной цепи являются интегрины — рецепторы клеточной мембраны, непосредственно связанные с белками матрикса и инициирующие сигналинг. Результаты множества исследований показывают, что интегрины участвуют в механизмах базисных физиологических реакций клетки (пролиферации, движении, дифференцировке, апоп-тозе и др.), модификации которых лежат в основе роста и прогрессии опухолей [4—7].
Интегрины представляют большое семейство — около 20 членов, каждый из которых является гетеродимером, состоящим из а- и р-це-пей, связанных нековалентными связями. Ин-тегриновые рецепторы различаются по лиганд-ной специфичности и уровню экспрессии в тканях млекопитающих. Наиболее распространенными и жизненно важными для клеток являются фибронектин-связывающий интегрин а5р1, коллаген-связывающий рецептор а2р1, а также интегрин аурЗ с более широкой лигандной специфичностью. Эти рецепторы составляют предмет подавляющего большинства исследований, направленных на выяснение роли интегрин-
опосредованного сигналинга в росте и прогрессии опухолей [8—10].
Результаты исследований отдельных интег-ринов во многом противоречивы. Это связано с многообразием интегринового семейства и сигнальных путей, которые могут индуцировать одни и те же рецепторы в разных клетках. Так, в наших работах была выявлена ранее не описанная роль интегрина avp3 в клеточных линиях карциномы кишечника человека и онкотранс-формированных фибробластов хомячка. В отличие от большинства исследованных опухолевых линий, в указанных клетках avp3 стимулировал аноикис [11, 12]. В недавней работе, посвященной сигналингу рецептора a5p1, нами было впервые продемонстрировано, что интегрин a5p1 участвует в регулировании роста клеток эпидеромоидной карциномы путем активациии рецептора эпидермального фактора роста и ин-гибирования их апоптотической гибели [13].
Роли интегрина a2p 1 в аноикисе опухолевых клеток посвящено небольшое число исследований, результаты которых неоднозначны. Наряду с доказательствами участия этого рецептора в защите клеток от аноикиса опубликованы данные, указывающие на его апоптогенную активность в некоторых типах клеток [14—16]. Возможное объяснение состоит в том, что a2p1, как и другие интегрины, может инициировать в разных клетках (в зависимости от физиологического статуса, стадии развития, взаимодействия с внешними и внутренними факторами и т.д.) сигнальные механизмы, контролирующие разнонаправленные клеточные реакции. Сигнальные пути, инициируемые рецептором a2p1, исследованы слабо. В настоящей работе впервые показано, что интегрин a2p1 участвует в защите от аноикиса клеток карциномы молочной железы человека через механизм, основанный на ин-гибировании сигнальной протеинкиназы Erk.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Клетки и реагенты. Линия MCF-7 клеток карциномы молочной железы человека получена в банке ATCC (США). Клетки культивировали в среде DMEM, содержавшей 10% сыворотки эмбрионов коров, 2 мМ L-глутамина, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, при 37° в атмосфере, содержавшей 5% СО2. В работе использовали также реагенты фирмы «Sigma» (США), за исключением специально оговоренных случаев. Поликлональные антитела к a2-HK-тегриновой субъединице и моноклональные антитела к интегрину a2p1 получены, соответственно, от фирм «Chemicon» и «BD PharMingen» (США).
Поликлональные антитела к протеинкиназам Akt, Erk и их фосфорилированным формам (pAkt Ser473 и pErk Thr202/Tyr204) получены от фирмы «Cell Signaling Tech» (США), ингибитор ки-назы Erk — соединение PD98059 — от «Calbio-chem» (США).
Трансдукция клеток мшРНК. Бактериальные глицериновые клоны NM_002203.2-1427s1c1 (#D3) и NM_002203.3-1561s21c1 (#D7), содержащие лентивирусный плазмидный вектор pLKO.1-puro c мшРНК для а2-интегриновой субъединицы, были куплены у фирмы «Sigma» (США). pLKO.1-puro — лентивирусный вектор без мшРНК («пустой» вектор) — был использован в качестве контроля. Лентивирусные частицы продуцировали в клетках HEK293T путем котрансфекции вектора, содержавшего мшРНК, или контрольного вектора c пакующими плаз-мидами, как описано ранее [13]. Клетки инфицировали лентивирусом в присутствии 8 мг/мл полибрена и проводили селекцию пуромици-ном (1—2 мг/мл) в течение 4—6 дней.
Субстрат-зависимый апоптоз (аноикис) оценивали по накоплению клеток с содержанием ДНК, меньшим, чем у диплоидных клеток (суб-G1 популяция) после их пассирования на неадгезивном субстрате — полигидроксиметилме-такрилате (поли-ГЕМА) [17]. Субстрат приготавливали в 6-луночных планшетах по описанной ранее процедуре [17]. 2 х 105 клеток вносили в лунку и инкубировали в среде, содержавшей 10% эмбриональной сыворотки, при 37° в течение 24 ч, после чего клетки обрабатывали для цитофлуориметрии.
Колониеобразование. 2000 клеток пассировали в 1%-ном геле метилцеллюлозы в полной среде в чашках Петри в течение 14 дней. Колонии окрашивали кристаллвиолетом. Чашки с колониями сканировали.
Цитофлуориметрия. 3—5 х 105 клеток фиксировали в 70%-ном этаноле, промывали фосфат-но-солевым буфером, добавляли 1 мл раствора иодида пропидия (50 мкг/мл) в цитратном буфере и 50 мкл раствора РНКазы А (10 мкг/мл) и инкубировали 3 ч при 4°. Для анализа экспрессии интегрина a2ß1 на клеточной поверхности клетки инкубировали с антителами к a2ß 1 («BD PharMingen», США), окрашивали ФИТЦ-конъ-югированными вторыми антителами и фиксировали в 2%-ном формальдегиде. Анализ клеток проводили в проточном цитофлуориметре «Becton Dickinson» (США).
Электрофорез в ПААГ и иммуноблоттинг проводили по описанной процедуре [18]. Клетки экстрагировали 50 мМ Tris-HCl-буфером (pH 7,5), содержавшим 1%-ный Тритон X-100, 150 мМ NaCl, 0,5%-ный дезоксихолат натрия, 0,1%-ный
Ds-Na, а также смесь протеазных и фосфатаз-ных ингибиторов («Santa Cruz Biotech», США) из расчета 1 мкл каждой смеси на 106 клеток, и центрифугировали 10 мин при 13 000 g. 30 мкг белков клеточного лизата разделяли с помощью электрофореза в Ds-Na-ПААГ и подвергали электропереносу на мембрану из поливинили-денфторида (ПВДФ). После инкубации с антителами мембрану обрабатывали вторыми антителами, конъюгированными с пероксидазой, проявляли в системе ECL («Amersham», Англия), экспонировали с рентгеновской пленкой и сканировали.
Статистический анализ. Различия между группами оценивали с помощью i-теста Стьюдента. Различия считались достоверными приp < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Блокирование сигналинга интегрина а2р1 снижает резистентность к аноикису и клонообра-зующую активность клеток MCF-7. Сигналинг интегрина а2р1 блокировали путем подавления его экспрессии а2-специфической мшРНК. При исследовании двух плазмидных клонов, экспрессирующих а2 мшРНК, оказалось, что клон D3 более эффективен в блокировании экспрессии указанного рецептора: по результатам вестерн-блоттинга содержание интегрина в лизате клеток, трансдуцированных этим клоном, уменьшалось по сравнению с контрольными клетками на 70%, а по данным цитофлуори-метрии поверхностная экспрессия рецептора снижалась в 2,5—3 раза (рис. 1). Дальнейшие исследования были проведены с более эффективным клоном.
Участие а2р1 в стрессе, индуцированном разрывом матрикс-клеточных контактов, оценивали по влиянию блокирования экспрессии этого рецептора на аноикис. Представленные на рис. 2 данные показывают, что снижение экспрессии а2р1 в клетках МСБ-7, сохранивших связь с субстратом, не влияет на их апопто-тическую гибель (рис. 2, а). Однако культивирование клеток со сниженным уровнем а2р1 на неадгезивном субстрате пов
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.