БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 6, с. 920 - 930
УДК 577.3
УЧАСТИЕ ИЗМЕНЕНИЙ ВНУТРИ-И ВНЕКЛЕТОЧНОГО рН В РАЗВИТИИ ВЫЗВАННОГО ВАРИАБЕЛЬНЫМ ПОТЕНЦИАЛОМ ФОТОСИНТЕТИЧЕСКОГО ОТВЕТА У ПРОРОСТКОВ
ТЫКВЫ
© 2015 О.Н. Шерстнева, В.А. Воденеев, Л.А. Катичева, Л.М. Сурова, В.С. Сухов*
Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского, 603950Нижний Новгород; электронная почта: vssuh@mail.ru
Поступила в редакцию 12.01.15 После доработки 09.03.15
Электрические сигналы, представленные у растений потенциалом действия и вариабельным потенциалом (ВП), вызывают обратимую инактивацию фотосинтеза. Связанное с генерацией ВП изменение внутри- и внеклеточного pH является потенциальным механизмом индукции фотосинтетического ответа, что, однако, требует дальнейшего экспериментального исследования. В настоящей работе анализировали влияние изменений pH на индукцию фотосинтетического ответа у тыквы. Показано, что ожог семядольного листа вызывал распространение ВП, который проходил в настоящие листья проростков тыквы, индуцируя снижение уровня фотосинтетической ассимиляции CO2 и рост нефотохимического тушения флуоресценции; дыхание при этом незначительно активировалось. Величина фотосинтетического ответа линейно зависела от амплитуды ВП. Проведенный с использованием pH-чувствительных флуоресцентных зондов анализ внутри- и внеклеточной концентрации протонов показал, что развитие ВП сопровождалось защелачивани-ем апопласта (0,4 ед pH) и закислением цитоплазмы (0,3 ед pH). Исследование влияния изменения pH среды инкубации на нефотохимическое тушение флуоресценции выделенных хлоропластов показало, что за-кисление среды повышало нефотохимическое тушение, при этом амплитуда такого возрастания зависела от величины снижения pH. Полученные результаты свидетельствуют в пользу участия изменений внутри- и внеклеточного pH в индукции вызванного ВП фотосинтетического ответа. Возможные механизмы влияния изменений pH на фотосинтез обсуждаются.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: Cucurbita pepo, pH, ассимиляция CO2, вариабельный потенциал, нефотохимическое тушение флуоресценции, хлоропласты.
В настоящее время достаточно хорошо известно [1—3], что локальные раздражения могут вызывать генерацию и распространение электрических сигналов у растений. При этом непов-реждающие стимулы индуцируют потенциал действия (ПД), а повреждающие воздействия приводят к распространению вариабельного потенциала (ВП) [1, 2]. ПД и ВП, по-видимому, отличаются в ионной природе и механизмах распространения. Активно распространяющийся ПД [4] связан преимущественно с потоками Са2+, С1- и К+ [1, 3, 5, 6], хотя обратимая инактивация Н+-АТФазы принимает определенное участие в его генерации [6]. В случае ВП основным механизмом является снижение активности Н+-АТФазы [3, 4, 7], которое, возможно, индуцировано входом ионов кальция [8, 9]. При
* Адресат для корреспонденции.
этом ионы хлора и калия, по-видимому, принимают участие преимущественно в формировании отдельных «ПД-образных» спайков [10], которые в некоторых случаях развиваются на фоне медленной и длительной деполяризации, являющейся основой ВП [2, 3, 11]. Распространение ВП не является активным процессом; считается, что он представляет собой местную электрическую реакцию на распространение сигнала гидравлической и(или) химической природы [3, 10, 12—14].
Предполагается [3, 15], что именно генерация и распространение ПД и ВП являются механизмом формирования системного функционального ответа растения на локальное действие раздражителей. В частности, показано, что локальная стимуляция может вызывать в нераздраженных частях растения активацию экспрессии ряда генов [16, 17], синтез фитогормонов
[17—19], изменения активности транспортных процессов [20], активацию дыхания [21] и сложные по своей динамике фотосинтетические ответы [19, 22—33]. Считается [34], что конечным результатом таких функциональных изменений является повышение устойчивости растения к действию неблагоприятных факторов, что подтверждается отдельными экспериментальными работами [33—35].
Наиболее активно исследуемыми функциональными ответами растения на локальное действие стрессоров являются фотосинтетические ответы. В первую очередь, это показанная для растений различных видов быстрая инактивация фотосинтеза, которая обычно достигает максимальных значений в пределах первых 2—15 мин после локального раздражения [19, 23—33]. Она проявляется в снижении уровня ассимиляции С02 (А), возрастании нефотохимического тушения флуоресценции (МРР), уменьшении квантовых выходов фотосистем I и II (фР81 и фР8П) и двухфазном изменении величины циклического потока электронов. Кроме быстрой инактивации фотосинтеза, в некоторых работах наблюдались также относительно медленно развивающиеся изменения фотосинтетической активности, которые достигали максимальной величины в пределах 20—50 мин после стимуляции [23, 32].
В отличие от медленно развивающихся фотосинтетических ответов, которые могут быть связаны не только с электрическими, но и с гормональными сигналами [19, 23], связь быстрой инактивации фотосинтеза с ПД и ВП была подтверждена в ряде работ [27, 29, 31, 32]. В то же время сам механизм влияния электрической реакции на фотосинтез остается достаточно дискуссионным. Исследование влияния ПД на фотосинтез харовых водорослей показало, что наиболее вероятным механизмом формирования ответа является вход ионов кальция [25]. Вариабельный потенциал, наблюдаемый преимущественно у высших растений, имеет специфические механизмы генерации и распространения [7—14], что позволяет предположить существование специфического пути влияния ВП на фотосинтез. Учитывая ключевую роль инактивации Н+-АТФазы в развитии ВП [3, 4, 7], его влияние может быть связано со входом протонов в клетку [27, 31]. Грамс с соавт. [27] показали, что распространение ВП у кукурузы сопровождается закислением цитоплазмы и защела-чиванием апопласта. При этом фотосинтез выделенных хлоропластов зависел от рН среды инкубации, в то время как его зависимости от концентрации кальция выявлено не было. Проведенный нами ранее анализ показал [31], что
вход протонов действительно является вероятным механизмом развития, вызванного ВП фотосинтетического ответа у проростков гороха. В то же время остается открытым вопрос — насколько универсальным для высших растений является такой механизм? Ранее было показано [30], что обратимая инактивация фотосинтеза, вызванная у проростков тыквы локальным ожогом и, вероятно, распространением ВП, существенно отличалась от ответов других исследованных объектов [29, 31, 32]. В частности, у тыквы наблюдалось лишь небольшое возрастание NPQ и снижение A, в то время как выраженное снижение фР81 и фР8П отсутствовало.
Таким образом, изучение влияния изменения внутри- и внеклеточного pH в индукции фотосинтетического ответа у проростков тыквы имеет значение для оценки универсальности роли протонов, в развитии вызванной ВП быстрой инактивации фотосинтеза у высших растений. Такой анализ стал целью настоящей работы.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектом исследования служили двух-трех-недельные проростки тыквы (Cucurbita pepo L., сорт Мозолеевская). Проростки выращивали гидропонным способом (керамзит, 50%-ная среда Хоглэнда—Арнона) в климатической камере (KBW-240, «Binder», Германия) при освещении люминесцентными лампами (16-часовой световой период) и температуре 24°.
Электрофизиологические измерения осуществляли экстраклеточно после полуторачасовой адаптации проростков (рис. 1). Для регистрации использовали две пары Ag/AgCl-макроэлектро-дов (ЭВЛ-1М3, «Гомельский завод измерительных приборов», Беларусь), высокоомный усилитель (ИПЛ-113, «Семико», Россия) и ПК. Измерительные электроды контактировали с основанием черешка листа (Е1) и поверхностью листа, на границе с зоной измерения фотосинтеза (Е2) через каплю электропроводящего геля. Электроды сравнения (Ек) контактировали с омывающим корни раствором. ВП индуцировали ожогом одного из семядольных листьев (открытое пламя, 3—4 с, около 2—3 см2 поверхности).
Фотосинтетические измерения проводили одновременно с регистрацией электрической активности. Для этого применяли стандартную систему для исследования фотосинтетических процессов («Heinz Walz GmbH», Германия), включающую в себя газоанализатор (GFS-3000), PAM-флуориметр с возможностью регистрации поглощения света фотосистемой I (Dual-PAM-100) и измерительную головку для их одновременно-
Регистрация уровня ассимиляции СО2 (А), нефотохимического тушения флуоресценции (NPQ), квантовых выходов фотосистем I и II (ФР31 и ФРЗП)
Рис. 1. Схема нанесения ожога, расположения электродов и регистрации параметров фотосинтеза у проростков тыквы. Е[ и Е2 — измерительные электроды, ЕR — электрод сравнения. Стрелкой обозначена область нанесения локального ожога семядольного листа (открытое пламя, 3—4 с, ~2—3 см2 поверхности)
го использования (Dual-PAM gas-exchange Cuvette 3010-Dual). В экспериментах на хлоро-пластах использовали только PAM-флуориметр. Длительность темновой адаптации составляла 20 мин (интактные растения) или 2 мин (выделенные хлоропласты), интенсивность последующего актиничного света (460 нм) равнялась 240 мкмоль м-2 с-1 (интактные растения) или 100 мкмоль м-2 с-1 (выделенные хлоропласты). Насыщающие вспышки следовали каждые 10 с. В экспериментах с интактными растениями концентрация углекислого газа в окружающей лист среде составляла 360 мкл л-1, а относительная влажность - около 60%. В работе исследовали уровень ассимиляции СО2 (А), нефотохимическое тушение флуоресценции (NPQ) и квантовые выходы фотосистем I и II (фР81 и фР811); параметры рассчитывали автоматически на основании подходов, представленных в работах [36-38]. Для исследования дыхания листа его газообмен измеряли в условиях полного затемнения.
Выделение хлоропластов осуществляли согласно предыдущим работам [30, 31]. 2 г настоящих листьев от одного проростка тыквы были гомогенизированы в 15 мл среды выделения (0,35 M NaCl в 0,06 М фосфатном буфере, pH 7,1) при температуре 4°. При той же температуре полученный гомогенат центрифугировали в течение 5 мин (200 g), после чег
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.