ФИЗИОЛОГИЯ ЖИВОТНЫХ ^^^^^^^^^^^^ И ЧЕЛОВЕКА
УДК 615.357.03:617-001.36].015.4.076.9
УЧАСТИЕ КАЛЬМОДУЛИНА В РЕАЛИЗАЦИИ ВАЗОКОНСТРИКТОРНЫХ ЭФФЕКТОВ СЕРОТОНИНА И НОРАДРЕНАЛИНА
© 2012 г. Л. М. Кожевникова*, П. В. Авдонин*, **
*НИИобщей патологии и патофизиологии РАМН, 125315 Москва, ул. Балтийская, 8 **Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, 119334 Москва, ул. Вавилова, 26
E-mail: lubovmih@yandex.ru Поступила в редакцию 20.06.2011 г.
Исследовано участие кальмодулина в адренергической и серотонинергической регуляции сократимости кровеносных сосудов. Ингибиторы кальмодулина трифлуоперазин и W-13 подавляют вазо-констрикторную реакцию аорты крысы в ответ на воздействие норадреналина, серотонина и агони-стов серотониновых 5НТ1А- и 5НТ2А-рецепторов 8-OH-DPAT и DOI соответственно, и не влияют на вазодилататорный эффект, реализованный через 5НТ1В-, 5НТ2В- и 5НТ4-рецепторы. Сила сокращения аорты в ответ на воздействие 8-OH-DPAT возрастает при активации входа кальция через потенциалуправляемые Са2+-каналы. Этот эффект не связан с неспецифической активацией ai-АР, поскольку он реализуется в присутствии празозина. Ингибитор кальмодулинзависимой киназы легких цепей миозина KN93 лишь на 20% снижает вазоконстрикторную реакцию на воздействие норадреналина и серотонина. Ингибиторы кальмодулина незначительно снижают сократительную реакцию сосудов на воздействие эндотелина-1, вазопрессина, ангиотензина II и KCl. Трифлуоперазин не подавляет вазоконстрикцию, вызванную активацией G-белков фторалюминатом. Мишенью трифлуоперазина и W-13, скорее всего, является кальмодулин, непосредственно взаимодействующий с вазоконстрикторными ai-адренорецепторами и 5НТ1А- и 5НТ2А-рецепторами серотонина.
Дисфункция серотонинергической системы вносит существенный вклад в этиологию и патогенез многочисленных психоневрологических и сердечно-сосудистых заболеваний, что делает 5НТ-рецепторы объектом пристального изучения и мишенью для лекарственных препаратов. Многообразие ответов на действие серотонина (5НТ) обусловлено наличием семи типов, включающих более 15 видов 5НТ-рецепторов, локализованных в различных структурах головного мозга, в гладкомышечных и эндотелиальных клетках сосудов, в сердечной мышце и в других органах (Villalon, Centurion, 2007). 5НТ-рецепторы, за исключением 5НТ3-типа, относятся к суперсемейству рецепторов, сопряженных с GTP-связываю-щими белками (GPCRs). Ранее мы показали, что при травматическом шоке, как и при длительном применении глюкокортикоидов, наблюдается инверсия сократительного ответа на действие 5НТ, которая проявляется в виде выраженной ва-зоконстрикции сосудов и подъема артериального давления (АД), вместо его снижения в норме. Выявлено, что сенситизация вазоконстрикторных 5НТ-рецепторов развивается при неизменном уровне их экспрессии и является результатом изменения свойств самих рецепторов. Показано, что в физиологических условиях вазоконстрик-торные 5НТ1А-рецепторы находятся в латентном
("молчащем") состоянии (Кожевникова и др., 2009, 2011; Кожевникова, Авдонин, 2010). Триг-герным механизмом их активации является возбуждение эндотелиновых (ЕТА), ангиотензиновых (АТ1А) или вазопрессиновых (V1A), но не а1-адре-норецепторов (а1-АР). В последние годы установлено, что помимо G-белков с рецепторами непосредственно взаимодействуют так называемые каркасные и адапторные белки, а также кальмодулин (СаМ) (Авдонин, Кожевникова, 2007). Нами была высказана гипотеза, согласно которой индуцированная ЕТА-, АТ1А- или V1A-рецепто-рами активация "молчащих" вазоконстриктор-ных 5НТ1А-рецепторов может быть опосредована внутриклеточными белками-адапторами, непосредственно взаимодействующими с внутриклеточными фрагментами их молекулы.
При возбуждении ЕТА-, АТ1А- или V^-ре-цепторов в цитоплазме клеток возрастает концентрация ионов кальция ([Са2+]цит). Основным сенсорным белком для ионов Са2+ является СаМ. В комплексе с ионами кальция (Са2+/СаМ) этот белок регулирует разнообразные физиологические процессы путем активации ферментов многочисленных сигнальных каскадов (Tebar et al., 2002; Vetter, Leclerc, 2003). В настоящее время идентифицированы участки связывания СаМ на серотониновых 5НТ1А-, 5НТ2А- и 5НТ2С-ре-
цепторах (Turner et al., 2004; Turner, Raymond, 2005; Raymond et al., 2006; Labasque et al., 2008). Функциональная значимость взаимодействия СаМ с 5НТ-рецепторами пока не изучена. Показано, что СаМ может связываться с N- и C-терми-нальным регионами третьей внутриклеточной (i3) петли 5НТ1А-рецепторов, которая в функциональном отношении является определяющей, поскольку в ней находятся участки взаимодействия с гетеротримерным комплексом G-белков (Turner et al., 2004). Механизмы активации рецепторов, находящихся в физиологических условиях в латентном ("молчащем") состоянии, до сих пор не изучены. Предполагают, что невозможность передачи лиганд-индуцированного сигнала от таких рецепторов связана с особенностями взаимодействия рецепторной молекулы с G-белками (Smith et al., 1999). С учетом результатов собственных исследований и данных литературы мы предположили, что СаМ может быть одним из белков, модулирующих передачу сигнала на уровне рецепторной молекулы и комплекса G-белков. Цель настоящего исследования — изучение возможной роли СаМ в регуляции сосудистого тонуса эндогенными вазоконстрикторными соединениями и в процессах индуцированной ими активации "молчащих" 5НТ1А-рецепторов, а также выявление возможного места действия СаМ в цепи передачи внутриклеточного сигнала от этих рецепторов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Работа выполнена на крысах-самцах породы Wistar массой 200—250 г. Наркотизированных введением 25%-ного раствора уретана (3 мл/кг) крыс декапетировали, извлекали грудной отдел аорты и помещали его в охлажденный физиологический раствор Кребса—Хенселейта. Сосуды очищали от жировой и соединительной тканей и нарезали на кольца шириной 1.5—2 мм. Кольцевые фрагменты сосудов крепили на держателях, помещенных в раствор Кребса—Хенселейта (37°С), аэрируемый смесью О2/СО2(95/5%). Силу сокращения изолированных фрагментов аорты измеряли в изометрическом режиме по методу Мульвани. Были использованы активаторы потенциал-управляемых кальциевых каналов плазматической мембраны (30 мМ KCl) и G-белков (фтора-люминат — 10 мМ NaF в присутствии 20 мкМ AlCl3). Функциональную активность рецепторов оценивали с помощью фармакологического анализа с применением селективных лигандов. Были использованы 5HT, норадреналин (НАдр), арги-нин-вазопрессин и эндотелин-1 (ЭТ-1) (Sigma, США), агонисты для рецепторов: 5НГ1А — 8-гид-рокси-2-(ди-пропиламино)-тетралин, (8-OH-DPAT Sigma), 5HT1B - CGS 12066B (Tocris, Великобритания), 5НТ2А - (±) DOI hydrochloride (DOI, Sig-
ma), 5HT2B - BW 723C86 (Axxora, США), муска-риновых рецепторов — карбахол (Sigma). Применяли антагонист агАР празозин (Sigma).
Изучение влияния ионов Ca2+ на активацию вазоконстрикторных 5НТ1А-рецепторов проводили на сосудах, в которых активировали потен-циалуправляемые кальциевые каналы с помощью 30 мМ KCl. Из данных литературы (Castillo et al., 1993; Yoshio et al., 2001; Villalobos-Molina et al., 2005) и результатов собственных исследований известно, что агонист 5НТ1А-рецепторов 8-OH-DPAT может взаимодействовать с а1-АР и вызывать вазоконстрикцию сосудов, находящихся в состоянии "покоя" (Кожевникова и др., 2009; Кожевникова, Авдонин, 2010). Поэтому при изучении индуцирующего влияния 30 мМ KCl на активность 5НТ1А-рецепторов мы исключали возможность взаимодействия 8-OH-DPAT с а1-АР путем предварительного воздействия на сосуды блокатором этих рецепторов празозином (10-7 М).
Для исследования роли CaM в регуляции функциональной активности рецепторов вазоак-тивных соединений использовали различные по химическому строению ингибиторы СаМ — N-^-ами-нобутил)-5-хлоро-1-нафталенсульфонамид (W-13, Alexis, США) и трифлуоперазин (TFP, Alexis), а также ингибитор СаМ-зависимой протеинкина-зы II (CaMKII) — KN93 (Alexis). Статистическая обработка данных проводилась в программе Sta-tistica 6.0 с использованием t-критерия Стьюден-та. Различия между показателями считали достоверными приp < 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Воздействие на изолированные кольца аорты крысы активатора потенциалуправляемых Са2+-ка-налов плазматической мембраны 30 мМ раствора KCl увеличивает силу их сокращения на 654 ± 41 мг. Предварительная инкубация сосудов с празози-ном не оказывает существенного влияния на величину и кинетику сокращения сосудов в ответ на действие 30 мМ KCl (рис. 1). Как видно из рис. 1а, празозин подавляет вазоконстрикторную реакцию на воздействие НАдр (10-7 М). В то же время добавление агониста 5НТ1А-рецепторов 8-OH-DPAT (10-5 М) к предварительно сокращенным 30 мМ KCl сосудам на фоне празозина приводит к приросту силы сокращения на 215 ± 33 мг. В тех случаях, когда в ответ на воздействие НАдр наблюдается незначительная вазоконстрикторная реакция, последующее воздействие на такие сосуды агони-стом 5НТ1А-рецепторов 8-OH-DPAT также сопровождается увеличением их силы сокращения (рис. 1б). Противоположный эффект на воздействие 8-OH-DPAT наблюдался на сосудах, пред-сокращенных 30 мМ KCl и НАдр в отсутствие празозина (рис. 1в). Добавление НАдр к сокращенным KCl сосудам приводило к значительному приросту силы их сокращения (на 453 ± 32 мг). В
КС1
I
(а)
8-OH-DPAT ИДдр \
I
(б) -OH-DPAT
____
KC 1 а нддр
н и rn 1 о з : р с ; 100 мг L 10 мин
ИДдр
I
КС1
I
-OH-DPAT
100 мг
L
10 мин
Рис. 1. Изменение силы сокращения сосудов в ответ на воздействие агониста 5НТ1А-рецепторов 8-ОН-ВРЛТ (10-5 М) на
фоне активации потенциалуправляемых Са2+-каналов 30 мМ KCl в присутствии (а, б) и в отсутствие (в) антагониста ai-АР празозина (10-7 М).
отсутствие празозина последующее воздействие на такие сосуды 8-ОН-ЭРЛТ сопровождалось уменьшением величины индуцированного НАдр сокращения в 1.5 раза (на 294 ± 50 мг), а не увеличением, как это наблюдается в присутствии празозина (рис. 1в). Эти результаты согласуются с ранее полученными данными о способности агониста 5НТ1А-рецепторов 8-ОН-ЭРЛТ релакси-ровать сосуды, сокращенные НАдр, но н
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.