НЕЙРОХИМИЯ, 2012, том 29, № 4, с. 283-286
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 577.156.7
УЧАСТИЕ ЛЕКТИНА pH3(40) В ТЕРМОРЕГУЛЯЦИИ ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫС
© 2012 г. Н. Г. Алексидзе*
Тбилисский государственный университет им. И. Джавахишвили, Тбилиси
В коре больших полушарий головного мозга крыс был обнаружен нейролектин рН3(40), количественное содержание которого изменяется в зависимости от температуры внешней среды. Наивысшая гемагглютинирующая активность лектина проявляется зимой. По сравнению с теплыми месяцами активность рН3(40) нейролектина в декабре возрастает более чем в 37 раз. Специфическими ингибиторами нейролектина является D-глюкозамин и К-ацетил^-глюкозамин. рН-оптимум активности нейролектина находится в диапазоне рН 5.0—8.5. Нейролектин рН3(40) в 2.5 раза активирует Са2+-АТФ-азу теней эритроцитов. Высказано предположение, что нейролектин рН3(40) принимает участие в процессах терморегуляции головного мозга.
Ключевые слова: лектин, гаптены, головной мозг.
ВВЕДЕНИЕ
Изучение функции лектинов растительного и животного происхождения привлекает все большее внимание ученых. Установлено, что лектины принимают активное участие в становлении структурно-функциональной организации клеток и субклеточных структур, в передаче метаболических сигналов, в процессах деления клеток, в реакции бласттрансформации и в других процессах. Лектины применяются в качестве информационных зондов для выявления наличия углеводов на поверхности мембран и других структурных образований, и, что особенно важно, лектины находят широкое применение в медицинской практике. Одно из характерных свойств лектинов — их способность агглютинировать различные виды клеток. Ряд лектинов проявляют гормональную, ферментную и митогенную активность. Лектиновую активность блокируют гаптены в виде углеводов и их производных. Лек-тины, как углеводсвязывающие белки, широко применяются в аффиной хроматографии для получения гликопротеинов наивысшей чистоты. Несмотря на то, что уже накоплен большой материал о структуре и функции лектинов, выявление и изучение новых лектинов нервной системы вновь остается одной из актуальных проблем современной нейролектинологии [1, 2].
Ранее проведенными исследованиями в головном мозге крыс был обнаружен мембраносвязан-ный специфический нейролектин рН3, количественное содержание которого изменялось в за-
*Адресат для корреспонденции: Грузия, 0105, Тбилиси, ул. Абано, 23, тел: (+995)79973807, e-mail: nugzar_aleksidze@ yahoo.com.
висимости от температуры экспозиционной среды, т.е. от времени года [3]. Исходя из сказанного, предпринимались исследования по разработке технологии выделения, очистке и изучению физико-химических показателей и функции ней-ролектина рН3.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В качестве объекта исследования использовались половозрелые белые крысы весом 100—120 г. Крысы находились в специальных контейнерах в течение года при температуре внешней среды. После декапитации мозг крысы очищали от крови 0.9%-ным раствором №С1, выделяли кору больших полушарий, подкорковое белое вещество и мозжечок, готовили 10%-ный гомогенат отмеченных выше тканей на агглютинирующем буфере (40 мМ К-фосфатный буфер +0.9%-ный раствор №С1, рН 7.4, КФБ), содержащий ингибитор протеиназ фенилметилсулфонил фторид в конечной концентрации 0.1 мМ. Гомогенат центрифугировали при 16000 g (центрифуга CLR, ИР) в течение 30 мин при температуре +4°С. С целью удаления растворимых белков осадок трижды промывали КФБ. Поскольку в головном мозге лектины преимущественно находятся в связанной форме [4, 5, 6] и комплекс легко распадается в кислой среде, осадок обрабатывали раствором глицин-НС1 (рН 3). Смесь оставляли при комнатной тепературе в течение 30 мин и вновь центрифугировали при 16000 g (30 мин). Супер-натант диализировали против агглютинирующего буфера (КФБ) в течение 24 ч при +4°С.
Агглютинирующую активность выделенных белков изучали на иммунологических планшетах
283
2*
284
АЛЕКСИДЗЕ
Таблица 1. Гемагглютинирующая активность экстрактов коры больших полушарий, белого вещества подкорки и мозжечка головного мозга крыс
Структуры головного мозга крыс Объем (мл) V Концентрация белка (мг/мл) Титр Т 1 Удельная активность лектина (мл/мг) Суммарная активность лектина (мг/мл)
Кора больших полушарий Белое вещество подкорки Мозжечок 3.6 ± 0.4 1.7 ± 0.2 2.2 ± 0.1 1.62 ± 0.10 3.97 ± 0.09 1.81 ± 0.07 128 ± 0.5 256 ± 1 32 ± 3 79.0 ± 0.8 35.2 ± 0.5 17.7 ± 0.4 461 ± 1 64.5 ± 0.8 70.4 ± 0.7
по методу Луцик и др. [7] на трипсинизированных кроличьих эритроцитах. Удельную активность ^А) оценивали по формуле: SA=Т-1 х С-1, где Т-1 — минимальная концентрация белка, при которой проявляется агглютинация трипсинизированных эритроцитов, С — концентрация белка (мг/мл) [4]. Концентрацию белка определяли по методу Лоури и др. [8]. Аффинную хроматографию экстракта белков гомогената коры больших полушарий головного мозга крыс после осаждения сульфатом аммония при 40%-ном насыщении проводили на трис-акрил-М-ацетил^-глюкозаминовой колонке. После хроматографии на трис-акрил-М-ацетил^-глюкозаминовой колонке с целью удаления балластных белков, колонку промывали буфером агглютинации, а связанные с трис-ак-рил-М-ацетил^-глюкозамином белки экстрагировали раствором глицин-НС1 (рН 3). Тени эритроцитов готовили по методу Мас-олива [9].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В первой серии опытов для экстракции нейро-лектинов из гомогенатов разных структур головного мозга крыс были испытаны различающиеся по рН буферные растворы: 1) КФБ (рН 6.5), 2) КФБ (рН 7.4), 3) КФБ + ЭДТА (рН 5.6), 4) вода + + 2 мМ ЭДТА (рН 5.7), 5) КФБ + 0.05%-ный тритон Х-100 и 6) 0.25 М глицин-Н^ (рН 3). Установлено, что гемагглютинирующая активность экстрактов головного мозга проявляется лишь в случае использования буферных растворов 3, 4 и 6, преимущественно имеющих кислую среду. Ре-
Таблица 2. Гемагглютинирующая активность белковой фракции рН3 нейролектина, выделенных при 40-, 60- и 80%-ном насыщении сульфатом аммония
Процент насыщения сульфатом аммония Концентрация белка (мг/мл) Титр,Т 1 Удельная активность (мл/мг)
0 1.5 ± 0.2 32 ± 2 21.3 ± 0.2
0-40% 1.7 ± 0.3 128 ± 3 75.3 ± 0.4
40-60% - - -
60-80% 2.1 - -
зультаты проведенных исследований представлены в табл. 1.
Как видно из табл. 1, наивысшая гемагглюти-нирующая активность проявляется в экстрактах коры больших полушарий (суммарная активность = 461 мг/мл). В дальнейшей серии опытов в качестве исследуемого объекта использовали кору больших полушарий.
С целью очистки экстрагируемого раствора белков коры больших полушарий головного мозга крыс на первом этапе фракционировали сульфатом аммония при 40-, 60- и 80%-ном насыщении. Было установлено, что максимальная гемаг-глютинирующая активность обнаруживается в экстрактах, выделенных при 40%-ном насыщении сульфатом аммония (табл. 2).
Из табл. 2 видно, что после фракционирования экстракта нейролектина рН3 сульфатом аммония гемагглютинирующая активность обнаруживалась лишь в экстрактах, выделенных при 40%-ном насыщении сульфатом аммония. Следовательно, нейролектин рН3 был назван лекти-ном рН3(40). Полученный экстракт фракционировали аффиной хроматографией на колонке трис-акрил-М-ацетил^-глюкозамина. После предварительного промывания колонки буфером агглютинации, раствором глицин-НС1 (рН 3) были экстрагированы иммобилизированные две белковые фракции (1, 2), которые проявляли высокую лектиновую активность. К сожалению, пока трудно судить об лектиновой активности отдельных фракций, так как на данном этапе гемаг-глютинирующую активность исследовали лишь в суммарной фракции белков 1 и 2 (рис. 1).
Особый интерес вызывало изучение чувствительности лектина к моносахаридам. В качестве моносахаридов использовали D-глюкозу, D-га-лактозу, D-маннозу и М-ацетил^-глюкозамин. К оттитрованному раствору нейролектина на иммунологические планшеты добавляли 0.6 М моносахариды в количестве 50 мкл и оставляли при комнатной температуре в течение 40 мин. Смесь слегка перемешивали и добавляли 2%-ную суспензию трипсинизированных кроличьих эритроцитов и через 1 ч визуально оценивали степень агглютинации. Результаты представлены в табл. 3.
Из табл. 3 видно, что в присутствии М-ацетил-D-глюкозамина и D-глюкозы гемагглютинирую-
УЧАСТИЕ ЛЕКТИНА pH3(40) В ТЕРМОРЕГУЛЯЦИИ ГОЛОВНОГО МОЗГА
285
8 12 16 18 Время элюции (мин)
Рис. 1. Аффинная хроматография нейролектина pH3(40) коры больших полушарий головного мозга крыс на колонке трис-акрил-^ацетил^-глюкозами-на методом жидкостной хроматографии. Изократная элюция, элюционный буфер — глицин-HCl (pH 3). Скорость элюции 1 мл/мин. Концентрация белков — 20 мкг/мл.
160 140 120 100 80 60 40 20 0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Рис. 2. Изменение удельной активности нейролектина pH3(40) коры больших полушарий головного мозга крыс в зависимости от температуры внешней среды при их экспозиции в течение года. На абсциссе — месяцы года: 1) январь, 2) декабрь, 3) ноябрь, 4) октябрь, 5) сентябрь, 6) август, 7) июль, 8) июнь, 9) май, 10) апрель, 11) март, 12) февраль. На ординате — удельная активность нейролектина.
0
4
щая активность нейролектина pH3(40) (белковые фракции 1, 2) ингибируется соответственно в 16 и 8 раз. Как видно, под влиянием М-ацетил^-глю-козамина и D-глюкозы блокируются углеводсвя-зывающие центры лектина pH3(40) и активность тормозится соответственно на 95 и 88%. Исходя из этих данных было сделано заключение, что N-ацетил-О-глюкозамин и D-глюкоза являются специфическими гаптенами лектина pH3(40).
После установления некоторых физико-химических показателей лектина исследовалось изменение количественного содержания нейролектина pH3(40) в головном мозге крыс в зависимости от температуры при их экспозиции в течение года в открытой среде. Полученные данные представлены на рис. 2.
Из рис. 2 видно, что количественное содержание нейролектина pH3(40), судя по его удельной
активности, строго зависит от температуры внешней среды, т.е. от времени года. Выясняется, что крысы как эндотермальные животные легко адаптируются к низким температурам, что выражается в усилении синтеза мембраносвязанного нейролектина pH3(40).
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.