НЕЙРОХИМИЯ, 2008, том 25, № 1-2, с. 99-104
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 612.815: 612.014.42
УЧАСТИЕ Н-ХОЛИНОРЕЦЕПТОРОВ НЕИРОНАЛЬНОГО ТИПА В РЕГУЛЯЦИИ ВЫБРОСА МЕДИАТОРА В НЕРВНО-МЫШЕЧНЫХ СИНАПСАХ МЫШИ
© 2008 г. В. В. Федорин*, О. П. Балезина
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет,
кафедра физиологии человека и животных
Показана способность низких доз никотина (10нМ) снижать квантовый состав потенциалов концевой пластинки в ходе кратковременной залповой активности нервно-мышечного синапса мыши. Каль-цийзависимость тормозных эффектов никотина, а также способность а-кобратоксина и апамина к их предотвращению позволяют предположить участие пресинаптических н-холинорецепторов (нХР) нейронального типа и кальцийактивируемых калиевых каналов в реализации эффектов никотина. Длительные залпы приводят к сходному с действием никотина снижению квантового состава потенциалов концевой пластинки, которое может быть предотвращено а-кобратоксином (2нМ).
Ключевые слова: нервно-мышечный синапс, никотин, ацетилхолиновый рецептор, альфа-кобра-токсин, апамин.
ВВЕДЕНИЕ
В современной литературе имеются морфологические данные о наличии нХР нейронального типа на моторных нервных терминалях [1]. Кроме того, описаны достоверные изменения передачи в моторных синапсах крысы при действии избирательных агонистов и антагонистов нХР нейронального типа [2]. Однако имеющиеся данные не позволяют дать однозначного ответа о физиологической значимости этих нХР и условиях, при которых они задействованы в моторных синапсах in vivo. В связи с этим целью нашей работы было, во-первых, исследовать пресинаптические эффекты никотина, являющегося в низких (наномоляр-ных) концентрациях избирательным агонистом нХР нейронального типа, и, во-вторых, выявить условия, при которых эндогенный ацетилхолин оказывает аналогичное никотину пресинаптиче-ское действие через активацию пресинаптических нХР нейронального типа.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
В качестве объекта исследования служил изолированный нервно-мышечный препарат мыши m. diaphragma - n. phrenicus. Предварительно наркотизированных эфиром животных декапитиро-вали и выделяли половину диафрагмальной мышцы вместе с частью диафрагмального нерва. Далее проводили "рассечение" нервно-мышечного
* Адресат для корреспонденции: Москва, Воробьевы горы, МГУ, биологический факультет; тел. (495) 245-32-65; е-шаП: vfedorin@gmail.com
препарата по Барстаду, после чего препарат помещали в камеру объемом 3 мл, перфузируемую оксигенированным (95% O2, 5% CO2) раствором Лайли, содержащим (мМ): NaCl - 135, KCl - 4, NaH2PO4 - 0.9, CaCl2 - 2.2, MgCl2 - 1, NaHCO3 -16.3, глюкоза - 11; (pH 7.2-7.4). При исследовании кальцийзависимости эффектов никотина в раствор вносилось не 2.2, а 1.1 мМ или 4.4 мМ CaCl2 (50 и 200 % от исходной концентрации соответственно). Стандартными микроэлектродами (сопротивление 5-10 МОм) внутриклеточно регистрировали миниатюрные потенциалы концевой пластинки (МПКП) (не менее 100 в каждом синапсе) и вызванные потенциалы концевой пластинки (ПКП) (не менее 50; в сериях длительного раздражения до 10000 последовательных ПКП). Для регистрации одиночных ПКП проводили стимуляцию диафрагмального нерва сверхпороговыми импульсами длительностью 0.08 мс с частотой 0.3 Гц. При изучении ритмической активности синапса использовались частоты 4, 7 и 50 Гц, запись длительных серий проводилась при частоте раздражения 50 Гц. Данные записывали на жесткий диск компьютера через аналого-цифровой преобразователь DigiLine с интерфейсом Digiscope, затем обрабатывали с использованием программ MiniAnalysis (Synaptosoft Co., USA). Сравнение контрольных и опытных выборок производилось по t-критерию Стьюдента (для амплитуды МПКП и ПКП) и критерию Манна-Уитни.
99
7*
Рис. 1. Влияние никотина (10 нМ) на рисунок ритмического залпа ПКП, генерируемых с различной частотой: 4 (а), 7 (б) и 50 Гц (в). Показаны огибающие рисунка залпа в контроле (1) и в присутствии никотина (2).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В предварительной серии экспериментов было установлено, что никотин в концентрации 0.11 мкМ при экспозиции более 10 с в омывающем растворе вызывает быстрое уменьшение амплитуды МПКП и ПКП до нуля вследствие десенси-тизации нХР мышечного типа на постсинаптиче-ской мембране [3].
Аппликация 10 нМ никотина сопровождалось быстрым (в течение 2-3 мин) падением амплитуды МПКП от 1.2 ± 0.1 мВ в контроле до 1.03 ± ± 0.07 мВ на фоне никотина (п = 7; р < 0.05). В течение следующих 2 ч действия 10 нМ никотина амплитуда МПКП монотонно снижалась до 60% от контрольного уровня (0.68 ± 0.04 мВ; п = 5; р < < 0.05). Времена нарастания и полуспада МПКП (1.32 ± 0.60 мс и 1.50 ± 0.63 мс в контроле) достоверно не изменялись под действием никотина и
составили соответственно 1.40 ± 0.60 мс и 1.52 ± ± 0.33 мс (n = 12; p > 0.05).
Никотин (10 нМ) вызывал достоверное снижение амплитуды одиночных вызванных ПКП от 16.3 ± 0.7 мВ в контроле до 13.0 ± 2.0 мВ (n = 14; p < 0.01), сопоставимое по динамике развития и величине с падением амплитуды МПКП. Квантовый состав одиночных ПКП на фоне никотина достоверно не изменился: 18.56 ± 0.71 в контроле (n = 15) и 18.31 ± 0.91 на фоне никотина (n = 23, p >
> 0.05).
Далее был проведен анализ коротких залпов ПКП, состоящих из 50 сигналов, следующих с частотой 4, 7 и 50 Гц (рис. 1). По ходу залпа имеют место закономерные изменения амплитуды ПКП: в начале залпа вслед за кратковременным увеличением амплитуды первых 3-15 ПКП залпа (при 7 и 50 Гц) происходит быстрое снижение амплитуды ПКП, и на протяжении остальной (основной) части залпа амплитуда ПКП сохраняются на постоянном (в масштабе нескольких сотен ПКП), но сниженном уровне, называемом фазой плато. В связи с этим основное внимание в последующих сериях экспериментов было сосредоточено на изменениях амплитуды ПКП на фазе плато.
В контроле уровень плато составил 79.6 ± 2.2% от амплитуды первого ПКП в залпе с частотой 4 Гц (n = 16), 82.8 ± 2.9% при 7 Гц (n = 15) и 88.6 ± ± 2.1% при 50 Гц (n = 15).
Мы установили, что под действием 10 нМ никотина уровень плато ПКП в залпе достоверно снижается при всех частотах залповой активности: при 4 Гц - на 9% (до 70.1 ± 2.1% от амплитуды первого ПКП в залпе (n = 16; p < 0.01)), при 7 Гц -на 6% (до 75.7 ± 2.7% (n = 14; p < 0.01)) и при 50 Гц -на 8% (до 79.9 ± 4.0% (n = 15; p < 0.01)).
Отсутствие изменений амплитуды МПКП до начала и после окончания залпа в присутствии никотина указывает на то, что снижение амплитуды ПКП в залпе связано с падением квантового состава, что, очевидно, является результатом пре-синаптического регуляторного действия экзогенного никотина, поэтому далее мы исследовали типы нХР и механизмы, опосредующие его тормозное действие.
Возможность участия нХР нейронального типа в реализации тормозных эффектов никотина исследовали с помощью а-кобратоксина (a-CTx), способного в наномолярных концентрациях избирательно блокировать нейрональные нХР (в том числе а7-типа) [3-6]. Мы установили, что сам а-CTx (5нМ) не вызывает достоверных изменений амплитуды как МПКП, так и одиночных ПКП, а также изменений амплитуды ПКП в залпе. На фоне a-CTx никотин (10 нМ) оказался неспособен уменьшать амплитуду ПКП на фазе плато (p >
> 0.01) (рис. 2). Этот факт свидетельствует в пользу возможного участия нХР нейронального типа в
тормозных эффектах никотина. Согласно последним исследованиям, часть нХР нейронального типа, особенно гомеомерные рецепторы а7-типа, обладает высокой проводимостью для ионов кальция [7]. Таким образом, кальцийзависимость обнаруженных тормозных эффектов никотина могла бы более точно указать на тип нХР, их опосредующих.
Для решения этого вопроса мы сравнили действие никотина на рисунок залпа ПКП при трех различных концентрациях кальция в наружном растворе (50, 100 и 200% от стандартной). Само по себе понижение в 2 раза концентрации кальция в омывающем растворе привело к достоверному увеличению уровня плато на всех исследованных частотах, тем более выраженному, чем выше была выбранная частота стимуляции, и составившему 81.5 ± 1.5% от амплитуды первого ПКП в залпе с частотой 4 Гц (n = 5), 88.1 ± 0.7% при 7 Гц (n = 5) и 112.8 ± 0.9% при 50 Гц (n = 6). Двукратное повышение концентрации ионов кальция в растворе, напротив, само по себе не привело к достоверным изменениям в уровне плато залпов.
В растворе со сниженной концентрацией наружного кальция (1.1 мМ) никотин (10 нМ) достоверно не изменял уровень плато в залпе по сравнению с соответствующим контролем при всех исследованных частотах: уровень ПКП на плато составил 85.3 ± 2.5% для 4 Гц (n = 4), 90.0 ± 2.0% для 7 Гц (n = 5) и 112.5 ± 1.8% для 50 Гц (n = 5). В то же время при повышенной (4.4 мМ) концентрации кальция в наружном растворе, эффекты никотина оказались более выраженными, нежели при стандартной концентрации. Уровень плато ПКП в залпе в присутствии 4,4мМ [Са]нар снижался под действием никотина при 4, 7 и 50 Гц соответственно на 13% до 67.1 ± 0.9% (n = 12, p < < 0.05), на 11% до 70.7 ± 1.5% (n = 11, p < 0.05) и на 18% до 71.8 ± 2.3% (n = 12, p < 0.05) (рис. 3).
В свете обнаруженной кальцийзависимости тормозных эффектов никотина мы предположили, что воздействие никотина на нХР терминалей может приводить к подавлению вызванного выброса АХ через активацию апаминчувствитель-ных кальцийактивируемых калиевых каналов терминали (КСа-каналов). Подобная ситуация имеет место в случае тормозного действия АХ на импульсную активность ряда возбудимых клеток [8-11]. Для проверки такой возможности мы использовали избирательный блокатор низкопро-водящих КСа-каналов - апамин (1мкМ). Мы установили, что апамин сам по себе не влияет на рисунок залпа при всех обследованных частотах (4, 7 и 50 Гц). Аппликация никотина в концентрации 10 нМ на фоне апамина (1 мкМ) привела к тому, что никотин оказался неспособным снижать амплитуду ПКП на фазе плато залпа (n = 7, p < 0.01),
% от первого ПКП 120
110 100 90 80 70 60 120
110
100
90
80
70
60 120
110 100 90 80 70 60
(б)
(в)
0 10 20 30 40 50
№ ПКП в залпе
Рис. 2. Огибающие рисунка залпов вызванных ПКП 4
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.