НЕЙРОХИМИЯ, 2011, том 28, № 4, с. 294-299
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 612.822:616.895:577.218
УЧАСТИЕ ТРАНСКРИПЦИОННОГО ФАКТОРА с-Гоэ В ФОРМИРОВАНИИ ПРОТЕКТИВНОГО ЭФФЕКТА ГИПОКСИЧЕСКОГО ПРЕКОНДИЦИОНИРОВАНИЯ В МОДЕЛИ ПОСТТРАВМАТИЧЕСКОГО СТРЕССОВОГО РАССТРОЙСТВА
© 2011 г. К. А. Баранова*, Е. А. Рыбникова, М. О. Самойлов
Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН, Санкт-Петербург
В данной работе методом количественной иммуноцитохимии были исследованы изменения экспрессии транскрипционного фактора с-Бо8 в гипоталамусе, гиппокампе и неокортексе крыс в ходе развития у них тревожного состояния в модели посттравматического стрессового расстройства (ПТСР), а также после применения гипоксического прекондиционирования, оказывающего выраженное анк-сиолитическое действие. Было обнаружено, что индукция экспериментального ПТСР сопровождается значительным и устойчивым повышением содержания фактора е-Бо8 во всех исследованных областях мозга. Максимальное по амплитуде (30-кратное) и длительности (до 10 сут) увеличение отмечается в гипоталамусе, где такая выраженная и устойчивая сверхэкспрессия может быть связана с характерной для ПТСР гиперпродукцией нейрогормона кортиколиберина. У животных, подвергнутых трехкратному прекондиционированию умеренной гипобарической гипоксией (360 мм рт. ст., 2 ч, с интервалом 24 ч) и не формирующих тревожную патологию в условиях травматического стрессор-ного водействия, обнаружено полное или частичное предотвращение сверхэкспрессии с-Бо8. Результаты свидетельствуют о том, что устойчивая сверхэкспрессия транскрипционного фактора с-Бо8 в не-окортексе, гиппокампе и гипоталамусе, очевидно, вовлекается в механизмы патогенеза ПТСР, в то время как ее предотвращение играет существенную роль в повышении устойчивости мозга к неблагоприятным воздействиям и защите от развития стресс-индуцированных патологий.
Ключевые слова: с-¥в$, гипоксическое прекондиционирование, посттравматическое стрессовое расстройство, нейропротекция.
ВВЕДЕНИЕ
Ген с-Гоб — это классический ранний ген, быстро активирующийся в ответ на многочисленные внешние воздействия, в том числе стрессорные, а его продукт — белок с-Боб — относят к группе ин-дуцибельных транскрипционных факторов, участвующих в организации стрессорного ответа организма, осуществляя регуляцию активности широкого спектра генов-мишеней. БоБ-белок содержит обогащенный положительно заряженными аминокислотами ДНК-связывающий регион и прилежащий к нему домен "лейциновой молнии", необходимый для димеризации с белками 1ип-семейства с образованием активного АР-1 фактора [1, 2]. Быстрая и кратковременная экспрессия фактора с-Боб отмечается в ответ на большинство физиологических и патофизиологических воздействий, его индукция может осуществляться факторами роста, нейротрансмитте-рами, гормонами и другими вторичными мессен-джерами с участием разнообразных киназных каскадов [2—5]. Однако для с-Боб описана более
* Адресат для корреспонденции: 199034, Санкт-Петербург, наб. Макарова, 6; тел. 8(911)234-54-53; e-mail: ksentippa@mail.ru.
специфичная отсроченная экспрессия, которая чаще связана с развитием патологического процесса, наблюдается при повреждающих и стрес-сорных воздействиях и может приводить к запуску апоптоза [6, 7]. В настоящее время большое внимание уделяется выявлению специфических пространственно-временных особенностей экспрессии этого фактора в мозге как при развитии патологии, так и при адаптивных реакциях. В связи с этим в настоящей работе была исследована динамика экспрессии с-Боб в гиппокампе, не-окортексе и гипоталамусе крыс в разные периоды развития тревожного состояния в модели посттравматического стрессового расстройства "стресс—рестресс" (ПТСР), а также у животных, предварительно подвергнутых гипоксическому прекондиционированию, оказывающему выраженное анксиолитическое действие и предотвращающему развитие тревожного состояния [8].
Таким образом, цель данного исследования состояла в сравнительном анализе динамики экспрессии транскрипционного фактора с-Боб в образованиях мозга крыс при развитии адаптивного и патологического ответа на патогенный стресс.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Эксперименты выполнены на самцах крыс линии Вистар с массой тела 180—250 г (n = 54), разделенных на три группы. Для индукции экспериментального аналога посттравматического стрессового расстройства у крыс использовали модель "стресс—рестресс" [9, 10]. Модель ПТСР — парадигма "стресс—рестресс" включала тяжелый травматический стресс (патогенный) и рестресс (напоминающий). Патогенный стресс состоял из двухчасового иммобилизационного стресса, 20 мин вынужденного плавания, и, после 15-минутного перерыва, краткосрочного воздействия эфиром до потери сознания. Рестресс, напоминающий о тяжелом травматическом стрессе и являющийся триггером для развития ПТСР, предъявлялся через 7 сут и представлял собой краткий эпизод первой составляющей травматического стресса — 30-минутную иммобилизацию.
Крысы первой экспериментальной группы подвергались действию "стресса—рестресса" и демонстрировали развитие постстрессовой ПТСР-пато-логии, о чем свидетельствовали показатели поведенческих и гормональных тестов [8, 11]. Животных второй группы перед стрессирующим воздействием подвергали гипоксическому прекон-диционированию, которое предотвращало у них развитие ПТСР [8]. Гипоксическое прекондицио-нирование осуществляли путем трехкратных сеансов умеренной гипобарической гипоксии [12]. Экспериментальных животных в барокамере проточного типа "поднимали" на условную высоту 5 км над уровнем моря (давление в камере — 360 мм рт. ст.) на 2 ч ежедневно в течение 3 сут с интервалом 24 ч, последнее прекондиционирующее воздействие проводилось за 24 ч до патогенного стресса. Третью группу крыс составляли контрольные животные, их троекратно помещали в барокамеру при отсутствии гипоксии.
Спустя 1, 5 и 10 сут после рестресса по шесть крыс из каждой группы декапитировали. Мозг быстро извлекали, выделяли области гиппокампа с прилежащей фронтопариетальной корой и область гипоталамуса. Выделенные области фиксировали молекулярным фиксатором FineFIX (Milestone, Italy). Далее препараты подвергали стандартным процедурам промывки, обезвоживания, проведения через порции ксилола и парафина и заливали в парафиновые блоки. Затем при помощи микротома изготавливали серии чередующихся срезов мозга во фронтальной плоскости толщиной 7 мкм на уровне —2.80 мм от брегмы [13]. Они использовались для количественной иммуноцитохимической оценки содержания белка — транскрипционного фактора с-Fos в нескольких областях мозга крыс: гипоталамус (крупноклеточное и мелкоклеточное паравентри-кулярное ядро — PVNm, PVNp), неокортекс (II и
V слои), дорзальный (СА1) и вентральный (зубчатая извилина — DG) гиппокамп. После стандартных процедур депарафинизации, регидратации и демаскировки антигена срезы в течение ночи при +4°C инкубировали с первичными поликлональ-ными кроличьими антителами к с-Fos (Abcam, Inc, USA, разв. 1 : 100), а далее использовали ави-дин-биотиновую систему детекции (Vector Laboratories, Inc, UK). Для визуализации реакции использовали диаминобензидин. Количественный анализ иммунореактивности нейронов проводили с использованием системы, состоящей из светового микроскопа Jenaval (Carl Zeiss, Germany), цифровой камеры Baumer CX05c (Baumer Optron-ic, Germany) и компьютера IBM PC с программным обеспечением Videotest Master Morphology. На основании оценки оптической плотности им-мунопозитивные клетки разделяли на два класса: слабо- и интенсивно иммунореактивные, анализировали общее число иммунореактивных клеток, и число интенсивно окрашенных клеток. Для каждого животного анализировали шесть гистологических препаратов, усредняли значения для каждой области мозга, эти значения статистически обрабатывали с помощью пакетов анализа данных STATISTICA 7.0 Stat Soft, Inc и Microsoft Excel'2002, использовали однофакторный дисперсионный анализ ANOVA (р < 0.05). Все результаты представлены по экспериментальным группам в виде среднего арифметического ± SEM (standard error of the mean). Результаты и SEM выражены в процентах от контрольных значений, которые приняты за 100%.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Индукция экспериментального ПТСР сопровождалась выраженным и устойчивым повышением уровня иммунореактивности к фактору c-Fos в мозге крыс. Повышение иммунореактивности к c-Fos отмечалось уже на первые сутки после рестресса и затрагивало все исследованные образования, однако число иммунопозитивных клеток увеличивалось сравнительно незначительно (на 41—45% — в гиппокампе, на 22—27% в неокор-тексе по сравнению с контролем, а в гипоталамусе этот показатель возрастал на 43—56%) (рис. 1а, в, д; рис. 3а, б). Вместе с тем в клетках гиппокам-па, неокортекса и гипоталамуса наблюдалось резкое и значительное увеличение интенсивности экспрессии c-Fos, о чем свидетельствовало многократное повышение числа клеток, интенсивно иммуннореактивных к этому белку. Так, в СА1 поле гиппокампа число интенсивно-иммунореак-тивных нейронов через 1 сут после рестресса составило 298%, а в зубчатой извилине — 432% от контроля. В неокортексе стрессированных крыс, на фоне сравнительно небольшого повышения общего числа иммуно-позитивных клеток, выяв-
%
150 120 90 60 30
% 150
120 -
90 -
60 -
30 -
%
120 90 60 30 0
1 сут
1 сут
1 сут
5 сут в
5 сут д
5 сут
10 сут
10 сут
10 сут
% 300
200
100
1 сут
%
500 400 300 200 100
%
2500
2000
1500 -
1000
500 -
1 сут
1 сут
5 сут
г
5 сут
5 сут
10 сут
10 сут
10 сут
Рис. 1. Изменения экспрессии с-Fos в гиппокампе (а, б — область СА1, в, г — зубчатая извилина) и неокортексе (д, е) не- и прекондиционированных крыс после рестресса в парадигме "стресс—рестресс".
Темные столбики — непрекондиционированные животные, формирующие ПТСР; светлые столбики — крысы, подвергнутые прекондиционированию, и не формирующие ПТСР; серые столбики — контрольная группа — 100% (непрекондиционированные, нестрессированные крысы). По оси ординат — количество иммунореактивных клеток, выраженное в процентах относительно контроля (100%); а, в, д — общее число имм
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.