БИОФИЗИКА, 2012, том 57, вып. 5, с. 832-839
== БИОФИЗИКА КЛЕТКИ= =
УДК 576.32.03:582.24
УЧАСТИЕ ЦИКЛИЧЕСКОГО З-5-АДЕНОЗИНМОНОФОСФАТА В P ЕГУЛЯЦИИ ДВИГАТЕЛЬНОГО ПОВЕДЕНИЯ ПЛАЗМОДИЯ Physarum polycephalum © 2012 г. Н.Б. Матвеева, В.А. Теплов, А.Р. Незвецкий, Т.Г. Орлова, С.И. Бейлина
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт теоретической и экспериментальной биофизики Pоссийской академии наук, 142290, Пущино Московской области, ул. Институтская, 3
E-mail: о//ке@кеЬ.гы Поступила в p едакцию 02.07.12 г.
На плазмодии миксомицета Physarum роЬусеркаЫт - гигантской многоядерной амебоидной клетке с автоколебательным характером подвижности - исследовалась возможность рецеп-торного управления двигательным поведением с уча стием секретируемых в среду автокринных факторов. В качестве таких факторов рассмотрены цАМФ (циклический аденозинмоно фосфат) и экстраклеточная цАМФ-специфичная фосфодиэстераза, об участии которой в контроле двигательного поведения плазмодия свидетельствует характер действия ее сильного ингибитора. Показано, что плазмодий секретирует цАМФ. Введение в подложку 0,1-1,0 мМ цАМФ вызывает задержку распластывания и перехода плазмодия к миграции, а при локальной аппликации - характерное для действия аттрактантов увеличение частоты колебаний сократительной активности и падение упругости эктоплазмы. Показана способность к положительному таксису в градиенте цАМФ и зависимость его реализации от состояния плазмодия. Тестовые образцы, полученные из мигрирующего плазмодия, в отличие от образцов из растущей культуры, создают альтернативные фронты, эффективно конкурирующие с фронтами, обращенными в сторону аттрактанта. Полученные данные подтверждают р анее высказанное нами предположение о том, что перемещение лидирующего края плазмодия Physarum ро1у-cephalыm определяется созданием локальных экстраклеточных градиентов цАМФ, возникающих в результате временной задержки между секрецией и гидролизом нуклеотида.
Ключевые слова: автокринная сигнализация, цАМФ, экстраклеточная цАМФ-специфичная фосфодиэстераза, плазмодий Physarum polycephalыm.
Physarum роЬусвркаЬиш относится к настоящим миксомицетам и в вегетативной стадии жизненного цикла представляет собой плазмодий - многоядерную подвижную клетку, у которой деление ядер разобщено с цитокинезом. Это свойство определяет необычайно широкий диапазон размеров плазмодия, рост которого ограничен только доступностью питательного субстрата. Погруженный в жидкую ср еду плазмодий фрагментируется и во встряхиваемой питательной среде может выращиваться в виде суспензии микроплазмодиев (округлых многоядер ных клеток диаметром 100-200 мкм). После переноса на поверхность подложки микроплазмодии начинают мигрировать и, сливаясь друг с другом, образуют макроплазмодий. Как в макро-, так и в микроплазмодиях протоплазма дифференцир ована на относительно стационар-
Сокращения: цАМФ - циклический 3',5'-аденозинмоно-фосфат; эФДЭ - экстраклеточная цАМФ-специфичная фосфодиэстераза, ДТТ - дитиотреитол, 5'-АМФ - 5'-аде-нозинмонофосфат.
ную гелеобразную эктоплазму и жидкую эндоплазму, текущую по пронизывающим эктоплазму каналам. Интенсивное возвратно-поступательное течение эндоплазмы по градиенту давления, создаваемого хорошо скоординированными в пространстве ритмическими сокращениями эктоплазмы, является основой локомо-ции плазмодия, перемещение которого определяется более мощным, либо более длительным течением эндоплазмы в направлении лидирующего края.
Истощение питательного субстрата по одному или нескольким компонентам стимулирует двигательную активность плазмодия, которая имеет регулярный характер и реализуется для почвенных амеб и тканевых клеток по общей программе, впервые детально описанной для культивируемых фибробластов [1]. Первой ее стадией является распластывание с формированием лидирующего края (фронта) по периферии клетки. При распластывании одновременно с увеличением площади идет структурирование
тела плазмодия, на пленке проступают каналы, собирающие протоплазму из соседних областей и тр анспортирующие ее к фронту. Этот процесс приводит к внутренним разрывам пленки и трансформации каналов в тяжи. Фронтальная зона начинает вырождаться в отдельных уча -стках, разбиваясь на несколько автономных фр онтов. Часто это происходит задолго до конца распластывания, конкурирующие фронты, попеременно активируясь, начинают перемещать плазмодий на субстр ате, пр одолжая растягивать его, затем один из фронтов становится ведущим, и плазмодий приобретает характерную «треугольную» или веерообразную форму. Далее он мигрирует, попеременно чер едуя фазы распластывания фронта и подтягивания хвоста.
Начало фазы распластывания предваряет увеличение частоты автоколебаний сократительной активности, подобное реакции плазмодия на введение в подложку аттрактанта в пространственно однородной концентрации [2]. Эта фаза сменяется плавным или скачкообразным ростом периода автоколебаний, коррелирующим по времени с увеличением скорости распластывания [3]. Xарактер изменения автоколебательного режима, напоминающий аппликацию и удаление аттрактанта, а также способность плазмодия избегать участков субстра -та, по которым он мигрировал ранее, позволили нам предположить, что в управлении его двигательным поведением участвуют автокринные продукты [3]. В настоящей работе мы подтвердили это предположение, показав, что плазмодии способны к взаимодействию др уг с другом через диффузионно-проницаемую подложку.
Важным свидетельством в пользу того, что в качестве потенциальных автокринных регулятор ов могут быть рассмотрены циклический 3',5'-аденозинмонофосфат (цАМФ) и экстр акле-точная цАМФ-специфичная фосфодиэстераза (эФДЭ), было обнаружение нами фосфодиэсте-разы циклических нуклеотидов в агаровых подложках, по которым мигрировал голодающий плазмодий [4]. Выделение и частичная очистка фермента продемонстрировали его специфичность к цАМФ, высокую стабильность, отсутствие чувствительности к ионам магния и инактивацию восстанавливающими агентами [4,5]. Введение в подложку дитиотреитола (ДТТ) -сильного ингибитора активности эФДЭ - вызвало подавление распластывания и перехода плазмодия в фазу миграции при длительном поддержании предваряющего распластывание режима «высокочастотных» автоколебаний [6]. Эти данные позволили нам предположить, что перемещение лидирующего края плазмодия определяется созданием локальных экстраклеточ-
ных градиентов цАМФ, возникающих в результате временной задержки между продукцией нуклеотида и секрецией гидролизующего его фер мента.
В настоящей работе выяснялось, соответствует ли этому пр едположению характер действия цАМФ на двигательное поведение плазмодия. С этой целью исследовалось влияние данного нуклеотида на распластывание, режим автоколебаний и способность стимулировать положительный таксис.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Культивирование плазмодия. Physarum poly-cephalum, штамм ВКМ(F) 3283, культивировали по методу [7] в виде встряхиваемой суспензии микроплазмодиев. Макроплазмодии, полученные в результате слияния микроплазмодиев, выр ащивали в поверхностной культуре по модифицированному методу [8] на подложке из 2% агарового геля с подкормкой овсяными хлопьями. Мигрирующий плазмодий использовали в опытах через 12 ч после подкормки.
Анализ нуклеотидного состава экстраклеточной среды после миграции плазмодия. Подложки, по которым мигрировал плазмодий, готовили так же, как для выделения из экстраклеточной среды эФДЭ [4], за исключением того, что вместо слоя агара в качестве миграционной подложки была использована смоченная контрольным раствором (HEPES 10 мМ, рН 4,6, CaCl2 0,1 мМ) фильтровальная бумага. Бумажную подложку площадью около 2 дм2, по которой мигрировал плазмодий, помещали в =50 мл дистиллированной воды и инкубировали при комнатной температуре около 12 ч. Контрольные опыты показали, что этого времени достаточно для экстракции > 95% нуклеотидов (цАМФ, АМФ, аденозин, АТФ, АДФ), нанесенных на фильтровальную бумагу в известном объеме и концентрации 1 мМ. После завер ше-ния 12-часовой инкубации экстракт из миграционной подложки центрифугировали 30 мин при 10000 g. Супернатант (= 50 мл) концентрировали до объема = 2 мл на роторном испарителе и затем дополнительно лиофилизовали до конечного объема около 500 мкл. Нуклео-тидный состав концентрата, полученного таким образом, анализировали методом тонкослойной хр оматографии на селикагелевых пластинах Kieselgel 60F254 (Merck, Германия). Анализируемый препарат последовательно наносили в стартовую зону около 20 раз в объемах по 0,5 мкл. В качестве маркеров использовали цАМФ, 5'-АМФ и аденозин в концентрациях 0,3 и 1,0 мМ, однократно наносимых в стартовые зоны
в объеме по 0,5 мкл. Разделение вели в смеси изопропанол:аммиак:вода в соотношении 7:1:2 (v/v). И спользуемые силикагелевые пластины со -держали краситель, связанный с сорбентом и флуоресцир ующий при облучении пластин светом с длиной волны 254 нм. Это позволяло после окончания разделения наблюдать анализируемые нуклеотиды в виде темных пятен. Сравнение размеров и степени потемнения пятен, обусловленных анализируемыми нуклеоти-дами, с соответствующими характеристиками пятен, полученных в результате разделения известных количеств нуклеотидов-маркеров, позволяет ориентировочно оценить содержание анализируемых нуклеотидов в пробе и, как следствие, их концентрацию в среде, по которой мигрировал плазмодий.
Автоколебания сократительной активности плазмодия регистрировали модифицированным оптическим методом [10], как локальные колебания толщины и пульсирующие перемещения края клетки. Экспериментальную камеру с плазмодием, помещенным на прозрачную подложку из агарового геля, фиксировали на столике микроскопа МПС 1 (ЛОМО, Россия), освещали снизу физиологически неактивным красным светом [11] и помещали так, чтобы изображение выбранного участка клетки проецировалось на отверстие в маске, установленной в фокальной плоскости микроскопа. Для освещения использовали светодиод LXHL-LD3C (Phi^s Limited, Голландия), преимуществом которого является отсутствие инфр акр асной составляющей и, ка
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.