ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2007, том 54, № 2, с. 312-315
КРАТКОЕ ^^^^^^^^^^^^^^^^ СООБЩЕНИЕ
УДК 581.1
УЛЬТРАСТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ХЛОРОПЛАСТОВ ЛИСТЬЕВ РАСТЕНИЙ ТАБАКА, ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ ГЕНОМ А9-АЦИЛ-ЛИПИДНОЙ ДЕСАТУРАЗЫ ИЗ Зупескососсш уикапш, В НОРМЕ И ПРИ ГИПОТЕРМИИ
© 2007 г. В. Н. Попов, Н. В. Кипайкина, Н. В. Астахова, Т. И. Трунова
Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, Москва
Поступила в редакцию 06.07.2006 г.
Исследовали изменения ультраструктурной организации хлоропластов при адаптации к гипотермии растений табака (МсоНапа шЬасит L.), трансформированных геном desC Д9-ацил-липидной десату-разы из термофильной цианобактерии Synechococcus vulcanus. Контролем служили растения, трансформированные пустым бинарным вектором pGA482. При оптимальной для роста температуре под влиянием трансформации в растениях уменьшалось число гран и общее число тилакоидов в хлоропласте параллельно с увеличением числа пластоглобул и занимаемой ими площади по сравнению с контролем. Холодовая экспозиция (6 суток при 10°С) растений табака контрольного варианта приводила к увеличению площади хлоропласта и граны, что свидетельствует о начале деструктивных изменений, выраженных в разбухании стромы хлоропласта, а также к некоторому снижению общего числа тилакоидов в хлоропласте. При охлаждении трансформированных растений, наоборот, уменьшалась площадь хлоропласта, граны и пластоглобулы. При этом число тилакоидов в гране заметно увеличивалось и общее число тилакоидов в хлоропласте за время холодовой экспозиции возрастало со 123 до 203. Сделан вывод, что экспрессия Д9-ацил-липидной десатуразы в трансформированных растениях обеспечивала формирование ультраструктуры клеток, характерной для растений холодоустойчивых генотипов.
Nicotiana шЬасыт - трансгенные растения - ацил-липидная десатураза - ультраструктура клеток - холодостойкость
ВВЕДЕНИЕ
В литературе имеются данные, свидетельствующие об адаптивных изменениях ультраструктуры клеток под действием пониженных неповре-ждающих температур, которые могут служить маркерами устойчивости растений к гипотермии. Так, в клетках растений озимой пшеницы при гипотермии наблюдается разрастание цитоплазмы, уменьшение объема вакуоли и повышение ее электронной плотности, увеличение числа мембранных элементов клетки и количества пластоглобул [1, 2]. У теплолюбивых растений под действием холода происходят деструктивные изменения ультраструктуры клеток: нарушается интактность тонопласта [3], разбухает строма хлоропластов [4], разрываются ламеллы и оболочка [5]. В связи с этим особый интерес представляют хлоропласты, поскольку сохранение
Адрес для корреспонденции: Попов Валерий Николаевич. 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений РАН. Факс: 007 (495) 977-80-18; электронная почта: trunova@ippras.ru
растением способности к фотосинтезу при низкой температуре рассматривается как необходимое условие приобретения устойчивости к холоду [6].
В зависимости от напряженности стрессорно-го фактора и продолжительности его действия, а также от степени устойчивости изучаемого вида изменения ультраструктуры клеток имеют разный характер. Так, например, у растений томата относительно холодостойкого сорта Сибирский скороспелый после длительного воздействия закаливающей температуры 6°С клетки листьев претерпевали изменения, которые выражались в уменьшении площади как самой клетки, так и цитоплазмы и хлоропластов. При этом наблюдали почти полное исчезновение крахмальных зерен, снижение числа хлоропластов, митохондрий, гран и количества тилакоидов в гране [7]. Авторы предположили, что такие изменения ультраструктуры клеток и хлоропластов томата можно отнести к числу не повреждений, а защитно-приспособительных реакций.
В связи с торможением роста в условиях пониженных температур холодостойкие растения, по-
видимому, не нуждаются в больших количествах продуктов фотосинтеза. В отличие от морозостойких растений, они также не располагают механизмом формирования устойчивости к льдообразованию, поэтому у этих растений отсутствует потребность в повышенном количестве продуктов фотосинтеза и энергии, необходимых для разрастания мембранных элементов клетки, обеспечивающих устойчивость к обезвоживающему и деформирующему действию льда [8].
Тем не менее, вопрос о модификации ультраструктуры клеток и ее органелл при адаптации теплолюбивых растений к низкой температуре до сих пор остается дискуссионным. В связи с этим мы исследовали ультраструктурную организацию клеток и хлоропластов листьев табака, относящегося к теплолюбивым растениям, в норме и после действия закаливающей температуры у контрольных растений и у более устойчивого генотипа, полученного в результате трансформации геном Д9-ацил-липидной десатуразы из Буп-всЬюсоссш vulcanus. Данный фермент осуществляет введение двойной связи в Д9-положении стеарата с образованием олеиновой кислоты, тем самым создавая субстрат для дальнейшего синтеза ди- и триеновых ЖК [9, 10]. Эти растения отличались от контроля большим содержанием липи-дов и входящих в их состав ненасыщенных ЖК, а также более высоким значением индекса ненасыщенности [11]. Изменение липидного метаболизма трансформантов приводило к значительному повышению холодоустойчивости этих растений, определяемой по выходу электролитов из поврежденной холодом ткани в водную фазу и по накоплению одного из продуктов перекисного окисления липидов - малонового диальдегида [11], а также повышало их устойчивость к окислительному стрессу, вызванному гипотермией [12].
Таким образом, в данной работе была поставлена цель, использовав два различающихся по холодоустойчивости генотипа растений табака, выявить изменения ультраструктуры хлоропластов растений трансформантов, устойчивых к действию низких положительных температур.
МЕТОДИКА
Объектом исследования служили теплолюбивые растения табака (И1сойапа tabacum L.), трансформированные геном desC Д9-ацил-липидной десатуразы из термофильной цианобактерии Буп-в^ососсш vulcanus под контролем промотора 35S. Экспрессия данного гена в растениях была подтверждена молекулярными методами [13]. Контролем служили растения табака, трансформированные пустым бинарным вектором pGA482 [13].
Растения табака культивировали в асептических условиях на агаризованной МС-среде, до-
полненной феруловой кислотой и канамицином, при температуре 22°C и 16-часовом фотопериоде. В экспериментах использовали растения в возрасте 20-25 суток.
Охлаждение вегетирующих растений проводили в климатической камере на свету интенсивностью 5 клк. В работе использовали длительные холодовые экспозиции (6 суток при температуре 10°C).
При исследовании ультраструктуры листья контрольных и трансформированных растений фиксировали в течение 4 ч 2.5%-ным глутаровым альдегидом в 0.1 М фосфатном буфере с рН 7.4. Затем после 4-кратной промывки тем же буфером материал дофиксировали 1%-ным раствором 0s04 и заливали в эпон 812. Ультратонкие срезы получали на ультрамикротоме LKB-3 ("LKB", Швеция) и контрастировали сначала насыщенным водным раствором уранилацетата при 37°С в течение 30 мин и затем лимоннокислым свинцом при комнатной температуре в течение 15 мин. Срезы просматривали в электронном микроскопе TEMSCAN 100CX2 ("JEOL", Япония). Морфо-метрические исследования проводили на приборе MOP-VIDEOPLAN фирмы "Reichert" (Австрия) [14].
Для электронно-микроскопических исследований брали пробы из четырех листьев шести растений каждого варианта. При морфометриче-ских исследованиях просматривали не менее 100 хлоропластов каждого варианта. В таблицах представлены средние арифметические значения и их стандартные ошибки.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В листьях растений, выращенных при 22°С, граны, равномерно распределенные по всей стро-ме хлоропласта, состояли в среднем из 7 тилакои-дов. В хлоропластах контрольного варианта крахмальные зерна встречались редко, а у трансгенных растений вообще отсутствовали (табл. 1).
Хлоропласты трансформированных растений табака при 22°С отличались от контрольных большей, примерно на 15%, площадью, а также большим числом и площадью, занимаемой пла-стоглобулами (табл. 2). Последнее свидетельствует об их более интенсивном липидном обмене. Это подтверждает и выявленное меньшее, по сравнению с контролем, число гран, и общее число тилакоидов в одном хлоропласте (табл. 1).
Таким образом, экспрессия гена desC Д9-ацил-липидной десатуразы привела к уменьшению числа гран и общего числа тилакоидов в хлоропласте параллельно с увеличением числа пластоглобул и занимаемой ими площади. Можно предположить, что снижение количества гран, вероятно, компенсировалось качеством липидных компонентов, входящих в состав мембран хлоропластов, что
314
ПОПОВ и др.
Таблица 1. Изменение численности структурных элементов хлоропласта контрольных и трансформированных растений табака после охлаждения
Количество в одном хлоропласте
Вариант крахмальных зерен пластоглобул гран тилакоидов в единичной гране общее число тилакоидов
Температура 22°С
Контроль 1.87 ± 0.24 2.45 ± 0.26 21.37 ± 0.55 7.05 ± 0.12 151
Трансформант 0 3.28 ± 0.22 17.66 ± 0.65 6.95 ± 0.15 123
Температура 10°С
Контроль 1.71 ± 0.15 2.44 ± 0.27 16.15 ± 0.55 8.99 ± 0.32 145
Трансформант 1.68 ± 0.12 3.08 ± 0.23 24.72 ± 0.45 8.21 ± 0.23 203
обеспечивало их большую текучесть за счет увеличения доли полиненасыщенных ЖК [11].
При адаптации к охлаждению растений обоих генотипов (10°С в течение 6 суток) не наблюдали видимых повреждений самих растений, однако были выявлены существенные различия в ультраструктуре хлоропластов.
Так, площади хлоропласта и граны в хлоропласте у контрольных растений после действия низкой температуры увеличились на 10% (табл. 2). Напротив, число гран в хлоропласте растений контрольного варианта заметно уменьшалось, а число тилакоидов в гране увеличивалось, что сопровождалось небольшим снижением общего числа тилакоидов в хлоропласте (табл. 1).
Холодовая экспозиция растений, трансформированных геном Д9-ацил-липидной десатуразы, в отличие от контрольных, сопровождалась уменьшением площади хлоро
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.