Процессы поглощения, транспорта и накопления Fe в растении жестко регулируются, что обеспечивает поддержание его оптимальной внутриклеточной концентрации. Потенциальная токсичность Fe связана с его способностью переходить из окисленной формы ^е3+) в восстановленную ^е2+) и обратно. Для оптимального развития растений важно не допускать преимущественного накопления восстановленной формы железа, способной катализировать образование токсичных гидроксильных радикалов в соответствии с реакцией Фентона: Fe2+ + Н202 —► Fe3+ + + ОН + ОН-. Подобная ситуация у растений возникает в условиях засоления [2, 3], на фоне действия солей тяжелых металлов, при нарушении гомео-стаза железа в процессе естественного старения, т.е. при воздействии на растения любых факторов, индуцирующих в них окислительный стресс.
Одним из способов детоксикации избытка Fe, свойственного всем живым организмам, включая растения, является образование железосодержащего белка негеминовой природы - ферритина, имеющего уникальную структуру [4]. Молекула ферритина состоит из центрального ядра, в котором располагается Fe, и окружающей его белковой оболочки (2-3 нм) [5]. Вновь образованный белок, лишенный Fe, называется апоферритин. Белковая оболочка, покрывающая ядро, состоит из 24 глобулярных субъединиц, каждая с мол. м. 18.5-21.0 кД. В электронном микроскопе при общепринятом контрастировании срезов цитратом свинца оболочка электронно-прозрачна и становится видимой только при негативном окрашивании. Молекулярная масса нативного апоферрити-на составляет 480-510 кДа [5, 6]. При образовании апоферритина субъединицы формируют центральную полость (диаметром 5-8 нм), которая в последующем загружается ионами Fe2+ [7]. Это железо концентрируется и кристаллизуется в гидроксид Fe3+, образующего минеральное ядро [7]. Ферритин сохраняет железо в безопасной для клетки окисленной форме Fe3+, которая не катализирует продукцию свободных радикалов кислорода. В ядре каждый атом Fe3+ окружен приблизительно шестью атомами кислорода на расстоянии 1.93 А [8]. В отличие от высоко консервативной белковой глобулы, структура железосодержащего ядра довольно вариабельна вследствие различий в составе, особенно в содержании неорганического фосфора [9]. Ферритины содержат неорганический фосфор, на 1 атом которого приходится 10-40 атомов Fe [10]. Помимо железа ферритин способен связывать и другие, в том числе и токсичные ионы (например, алюминий, бериллий) [8]. Общая молекулярная масса ферритина может достигать 900 кД за счет включения кластера железа [5]. Однако, как правило, молекула ферритина обычно не полностью насыщена железом, и по этой причине ферритин обла-
дает промежуточной молекулярной массой между апоферритином и полностью заполненным хо-лоферритином [8]. Эвакуация Fe из ферритина происходит посредством пор в белковой оболочке, которые связывают поверхность белка с Fe-содержащим ядром. При прохождении Fe3+ через поры происходит его восстановление до Fe2+ [4].
Молекулы ферритина, имеющие размер 10-12 нм, идентифицируются в электронном микроскопе в виде электронно-плотных частиц благодаря находящемуся в них Fe [5]. В зависимости от характера расположения ферритиновых молекул в строме пластид различают 4 его типа [5]. Первый тип (аморфное гранулирование) - очень плотно собранные частицы внутри кластера без структурной идентификации отдельных частиц. Второй тип (разрозненный, свободный или scattered) - неплотно расположенные гранулы ферритина в небольших группах прямых или изогнутых рядов. Третий тип (паракристаллический) - неправильное паракристаллическое расположение прямых или дугообразных рядов. Четвертый тип (решетчатый или lattice-like) - решетчато-подобная, вы-сокоупорядоченная кристаллическая структура.
Большая часть активного железа (до 80%), которое вовлечено в различные биохимические реакции, локализована в хлоропластах [5]. Ферритин часто аккумулируется в пластидах клеток стареющих тканей [5, 11], в фотосинтетически неактивных хлоропластах [12, 13], в пластидах тканей стебля, либо в слабо фотосинтезирующих тканях. К последним относятся пластиды, расположенные в сопровождающих и других парен-химных клетках флоэмы, в ситовидных элементах флоэмы [14, 15], в камбиальной зоне [16]. Кроме того, ферритин отмечался в пластидах корней, которые вообще не являются фотосинте-зирующими [17]. В семенах ферритин является основной формой для длительного запасания Fe [4]. Химическая обработка растений никотином, озоном, стрептомицином, этиленом [5] также ведет к аккумуляции электронно-плотных частиц ферритина.
До недавнего времени считали, что ферритин обнаруживается исключительно в пластидах высших растений [5], однако позднее ферритин был идентифицирован также в цитоплазме [18] и в митохондриях [19].
В настоящее время мало что известно относительно других форм внутриклеточного хранения Fe, таких же безопасных и доступных, как ферритин. Железо, связанное с ферритином, находится в равновесии с пулом растворимого внутриклеточного Fe и может, таким образом, выступать в качестве буфера, контролирующего скорость поглощения Fe. Поступившие в цитоплазму ионы металлов могут связываться либо с низкомолекулярными органическими молекулами (аминокис-
лотами, органическими кислотами), либо с полипептидами, такими как металлотионеины и фитохе-латины. Известно, что Fe-содержащие хелатные комплексы могут проникать в вакуоль или выводиться из клеток [20, 21]. Скопление Fe за пределами клеток отмечалось в апопласте корня сои, устойчивой к дифициту Fe [22]. При экспонировании отрезков корней проростков ячменя в питательном растворе в присутствии 5^е обнаружено, что большая часть меченого Fe сосредоточена в виде осадка во внеклеточной зоне [23].
В условиях интенсивного фотосинтеза хлоро-пласты имеют низкое содержание ферритина [4]. При снижении фотосинтетической активности вследствие, например, старения или изменения условий окружающей среды, Fe мало используется, и поэтому его избыток запасается в форме ферритина [5]. Однако, как видно из работ, приведенных выше, больше всего ферритина выявляется не в фотосинтезирующих тканях, где Fe используется наиболее активно, а в тканях, фото-синтетически менее активных. Причины локализации ферритина в хлоропластах сосудистой паренхимы не известны. В одной из работ высказывалось предположение, что железо, поступающее в лист, при его кратковременном избытке может быть быстро мобилизовано для экспорта, поскольку большая его часть локализуется недалеко от сосудов. Железо, которое достигает мезо-фильных клеток, запасается в ферритине, а при освобождении из ферритина, вероятно, используется самими клетками, а не на экспорт [24].
Роль ферритина в регуляции окислительно-восстановительных реакций с участием железа может оказаться особенно важной у растений, подвергающихся воздействию стрессовых факторов. Ранее мы обнаружили накопление ферритина в хлоропластах мезофилла первичных листьев у галофита Mesembryanthemum crystallinum в условиях засоления и при совместном действии засоления и экзогенного путресцина [25]. При этом аккумуляция ферритина коррелировала со значительным повышением активности антиоксидант-ных ферментов, что служило косвенным свидетельством в пользу интенсивного образования при стрессе перекиси водорода [26]. Разложение перекиси водорода с образованием самой токсичной формы кислорода - гидроксил-радикала - катализируется ионами Fe2+. Удаление внутриклеточного Fe2+ путем его связывания ферритином выполняет защитную функцию, поскольку тормозит разложение перекиси водорода и, тем самым, генерацию гидроксил-радикала. Причем, наиболее интенсивная аккумуляция ферритина, как правило, наблюдается в хлоропластах около сосудистой паренхимы [25].
Причины подобной локализации ферритина у растений оставались до настоящего времени не-
выясненными. В связи с этим цель данной работы заключалась в более детальном исследовании локализации и особенностей структуры ферритина в паренхиме сосудов, а также в поиске других форм (способов) детоксикации железа у растений, видимых при электронно-микроскопическом исследовании.
МЕТОДИКА
Растения хрустальной травки (Mesembryanthe-тит crystallmum L.) выращивали из семян в течение 5 нед. в почвенной культуре в оранжерее Института физиологии растений РАН при естественном освещении в течение мая-июня. С начала образования 3-й пары листьев (ювенильная стадия развития) растения рассаживали по одному в вегетационные сосуды с 0.5 кг почвы и подвергали их действию засоления и обработке листьев раствором экзогенного путресцина.
Засоление создавали ежедневным поливом почвы 100 мМ раствором №С1 по 100 мл в течение первых трех суток, следующие трое суток растения поливали только водой. Одновременно листья опытных растений дважды в день (в течение 6 дней) опрыскивали 1 мМ раствором путресцина. Общая доза путресцина составляла 12 мкМ на одно растение. Для повышения проницаемости кутикулярного слоя листьев в раствор путресцина добавляли 0.05%-ный Твин 80.
Для электронно-микроскопического анализа брали листья на 6-е сутки опыта, когда наблюдались контрастные изменения в содержании ферритина [25] у контрольных и опытных растений. Кусочки листьев из средней части листовой пластинки между крупными жилками фиксировали в буферных растворах глютаральдегида, а затем OsO4 на холоду. Для идентификации ферритина и, возможно, других Fe-содержащиx включений часть электронно-микроскопических исследований проводили без окрашивания срезов цитратом свинца по Рейнольдсу. В работах ряда авторов [5, 16, 27] показано, что Fe придает содержащим его включениям дополнительный контраст и поэтому на неокрашенных срезах ферритин выглядит электронно-плотным по сравнению со слабо-окрашенными клеточными структурами.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Исследование ферритина в листьях растений, обработанных экзогенным путресцином в условиях засоления
При исследовании различных клеток около сосудистой паренхимы в листе М. crystallinum было отмечено, что хлоропласты клеток обкладки часто были перегружены ферритином. Площадь, занимаемая ферритином, достигала 1/4-1/6 от
площади среза хлор
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.