БИОФИЗИКА, 2013, том 58, вып. 1, с. 36-46
МОЛЕКУЛЯР НАЯ БИОФИЗИКА =
УДК 577.3
УЛЬТРАЗВУКОВОЕ РАСЩЕПЛЕНИЕ ДНК В КОМПЛЕКСАХ С КАТИОНАМИ Ag(I), Cu(II), Hg(II)
© 2013 г. С.Л. Гроховский*, И.А. Ильичева*, Л.А. Панченко***, М.В. Головкин*, Д.Ю. Нечипуренко**, Р.В. Полозов****, Ю.Д. Нечипуренко* **
*
Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, 119991, Москва, ул. Вавилова, 32;
**
Физический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова,
119991, Москва, Воробьевы горы;
Биологический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова,
119991, Москва, Воробьевы горы;
**** Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290, ПущиноМосковской области
E-mail: grok@eimb.ru, imb_irina@rambler.ru, песк@ешЬ.т Поступила в p едакцию 24.09.12 г.
И сследовано ультразвуковое ра сщепление фрагментов ДНК, связанных с катионами переходных металлов Ag(I), Cu(II) и Hg(II). П роведенный статистический анализ позволил оценить влияние типа катиона и его концентрации на относительную интенсивность расщепления в каждом из 16 динуклеотидов. Каждый из катионов может вызвать два принципиально различных варианта искажения двойной спирали в зависимости от того, происходит его координация по широкой или узкой бороздке ДНК. Уменьшение интенсивности расщепления наблюдается в тех случаях, когда катионы связываются по широкой бороздке ДНК; увеличение интенсивности расщепления происходит в результате возмущения, вносимого катионами в структуру водородных связей комплементарных пар азотистых оснований, или в результате интеркаляции катионов. Оба типа деформации структуры ДНК способны повлиять на интенсивность NoS интерконверсии дезоксирибозы.
Ключевые слова: ДНК, комплексы переходный металл-ДНК, ультразвуковое расщепление ДНК, псевдовращение цикла в-О-дезоксирибозы.
Катионы переходных металлов обр азуют устойчивые комплексы с ДНК, координируясь в местах, имеющих высокую плотность делока-лизованных электронов [1]. Значения их констант связывания с ДНК выше, чем у катионов щелочноземельных металлов, и, кроме того, уже при низких концентрациях (около 10-5 М) катионы переходных металлов способны связываться с азотистыми основаниями, что приводит к изменениям конформации ДНК, вплоть до значительных перестроек ее структуры. П ри этом может происходить как стабилизация, так и дестабилизация двойной спирали ДНК. Катионы переходных металлов обр азуют с ДНК и с олигонуклеотидами различные варианты комплексов. Их структура зависит в первую очер едь от типа катиона и молярного соотношения г - число связанных катионов/число фосфатных групп, на которое в существенной степени влияет концентрация катионов в растворе. Особенности нуклеотидной последовательности также могут повлиять на тип образующихся комплексов. Среди возможных вариантов свя-
зывания переходных металлов с ДНК можно выделить ассоциаты с кислородами фосфатных групп, хелатные комплексы с азотистыми основаниями и смешанные хелаты между фосфатами и гетероатомами азотистых оснований; возможно также интеркалирование катионов между плоскостями пар оснований с образованием комплексов типа «сэндвич» и встраивание катионов в комплементарные пары [1-4].
Исследования комплексов катионов с ДНК, выполненные различными методами (ИК- и УФ -спектроскопия, круговой дихроизм, ЯМР, седиментация, вискозиметрия, рентгенострук-тур ный анализ) показали, что катионы А§(1) и Ы§(П) образуют координационные связи только с атомами оснований, а катионы Си(11) как с фосфатными группами, так и с атомами о снований.
В настоящей р аботе мы исследовали ультразвуковое ра сщепление ДНК, связанной с катионами А§(1), Си(11) и Ы§(П). Расщепление фрагментов свободной ДНК под действием ультразвука на их растворы были исследованы
нами ранее [5-7]. Оказалось, что интенсивность ра сщепления конкретной межнуклеотидной связи зависит как от типа нуклеотидов, которые она связывает, так и от соседних нуклеотидов. С опоставление полученных значений интенсив-ностей ультразвукового расщепления различных тетрануклеотидов с известными из литературы данными по конформационной динамике свободной ДНК дало нам основание предположить существование зависимости между интенсивностью N^Б-переходов цикла дезок-сирибозы на 5'-конце центрального динуклео-тида и относительной интенсивностью его расщепления [7,8]. Целью нашей работы является исследование характерных особенностей расщепления ДНК в комплексах с переходными металлами и возможность их интерпретации на основе полагаемой нами связи между локальной динамикой ДНК и хар актерными особенностями р асщепления.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Меченые рестриктные фрагменты ДНК получали по методикам, опубликованным ранее [7]. Последовательности фрагментов и другие сопутствующие статье материалы приведены на сайте Ы1р://§г oh.ru/imb.
Облучение фрагментов ДНК ультразвуком.
Для приготовления облучаемых ультразвуком образцов 10 мкл растворов фрагментов ДНК (пример но 104 Бк) в воде смешивали с 10 мкл растворов ацетатных солей металлов в 0,2 М NaOAc, рН 6,0 в тонкостенных полипропиленовых пробирках на 0,2 мл и выдерживали в темноте при +4°С в течение 24 ч. Конечная концентрация ДНК составляла около 20 мкМ пар оснований, или 40 мкМ фосфатных групп. (Концентрации катионов металлов в каждой группе опытов указаны в подписях к рисункам и таблицам). Облучение проводили с помощью ультразвукового диспергатора УЗДН-2Т (Украина). И спользовали частоту 22 кГц пр и максимальной мощности. Продолжительность облучения образцов изменялась от 2 до 16 мин. Его проводили сериями по 2 мин. Пробирки с фрагментами ДНК помещали в тефлоновое кольцо, имеющее центральное отверстие 15 мм и радиальные отверстия для пробирок. Концы пробирок, в которых находились тестируемые растворы, располагали на расстоянии около 0,5 см ниже поверхности торца излучателя, диаметр которого составлял 12 мм. Кольцо закрепляли на дне бани со смесью воды и мелкор азмоло-того льда. Через каждые 2 мин кольцо переворачивали на 180°, и, если пр оисходило сме-
щение капель растворов, пр обирки подвергали короткому центрифугированию.
Разделение фрагментов в денатурирующем геле проводили в соответствии с методикой, описанной в работе [7]. После воздействия ультразвука на обр азцы двуспиральной ДНК, со -держащей радиоактивную метку на конце одной из цепей, проводили их денатурацию, и р еак -ционные смеси разделяли в геле. На каждой дорожке образовывались серии полос, которые соответствуют разрывам между нуклеотидами меченой цепи фрагмента. На рис. 1 пр иведены типичные электрофоретические профили расщепления ДНК ультразвуком, получаемые после сканирования флуоресцентного экрана, экспонированного на денатурирующем полиакри-ламидном геле после разделения фр агментов.
Для количественной обработки данных по расщеплению фрагментов ДНК ультразвуком необходимо получить численные значения ин-тенсивностей всех полос на геле. Для этого мы использовали компьютерную прогр амму SAFA [10]. П рограмма позволяет вычислять интенсивность каждой полосы на всех дор ожках и со -отнести их с заданной последовательностью нуклеотидов. Абсолютные величины интенсив-ностей полос на геле сильно варьир уют в разных экспериментах, поэтому мы проводили нормализацию их значений. Изменение интенсивности полос на геле может охватывать как всю дорожку целиком (когда разные дорожки одного геля имеют различную общую интенсивность), но может происходить увеличение или уменьшение значений интенсивности полос и по длине дор ожки. Для удаления такого р ода трендов, возникающих как на стадиях обработки фрагментов ДНК, так и при последующем их разделении на геле, нами был использован «метод скользящего среднего» с разными размер ами «окна» и введена величина относительной интенсивности ра сщепления г-й полосы, R¡. Варьирование величины «окна» показало, что оптимальной является величина «окна» в 31 нуклеотид. Всего было проанализировано 20 гелей для катиона Ag(I), 30 - для Hg(II) и 20 -для Cu(II).
Статистический анализ интенсивностей расщепления динуклеотидов в ДНК, связанной с катионами Cu(II), Ag(I), Hg(II). Нами были получены экспер иментальные данные относительной интенсивности расщепления ультразвуком фосфодиэфирных связей после каждого из че-тыр ех нуклеотидов и в каждом из 16 динуклеотидов. Ультразвуковое расщепление регистрировали во фрагментах свободной ДНК и в тех же фрагментах ее комплексов с одним из катионов: Ag(I) при концентр ациях 0,25; 0,50; 1,00
Рис. 1. Профили р асщепления фрагмента ДНК длиной 166 п.о. из плазмиды рБК-322 (нуклеотиды 3159-3325) в 6%-м денатурирующем полиакриламидном геле. (а) - Радиоактивная метка находилась в 3'-конце верхней цепи, (б) - на нижней. Дорожки 1, 7, 13 - комплексы меченых фрагментов с 1,0 мМ катионов металлов без облучения ультразвуком; 2, 8, 14, 19 - обработка муравьиной кислотой в присутствии дифениламина [10]; 3, 9, 15 - после облучения фрагментов ультразвуком в течение 12 мин в отсутствие катионов в растворах; 4-6, 10-12, 16-18 - после облучение фрагментов ультразвуком в течение 12 мин в растворах катионов в концентрациях 1,0; 0,5 и 0,25 мМ соответственно.
мМ; Си(11) при концентрациях 0,125; 0,25; 0,50; 1,00 мМ); Ы§(П) при концентрациях 0,25; 0,50; 1,00 мМ. Таблицы основных выборочных ха-рактеристик этих экспериментальных данных приведены на сайте ЬМр^гоЬ.гиЛтЪ.
Для исследования влияния фактора концентрации каждого из катионов, А§(1), Си(11),
Hg(II), на интенсивность расщепления ДНК в комплексах с катионами мы применяли одно-факторный дисперсионный анализ и непараметрические критерии (Kruskal-Wallis test, Brown-Mood test, Friedman test) [11,12]. В качестве зависимой переменной ра ссматривали R-величину относительной интенсивности расще-
P ис. 2. Зависимости относительной интенсивности ультр азвукового ра сщепления R после каждого из нуклеотидов от концентрации катионов Ag(I) (7), Cu(II) (2), Hg(II) (3).
пления, фр агментов свободной ДНК и их комплексов пр и указанных выше концентр ациях катионов. На рис. 2 приведены графики зависимости относительной интенсивности ра сщепления
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.