Ш
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2012, том 38, № 5, с. 569-576
УДК 575.224
УНИКАЛЬНЫЙ ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНА СУР21Л2, КОДИРУЮЩЕГО 21-ГИДРОКСИЛАЗУ, У ПАЦИЕНТОК С ПРИЗНАКАМИ ГИПЕРАНДРОГЕНИИ
© 2012 г. А. П. Баранник*, #, Н. В. Лаврова**, И. А. Шилов**, А. А. Колтунова***,
Л. А. Озолиня***, Л. И. Патрушев*
*Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997ГСП, Москва, В4437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 **Государственноеучреждение "Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии
им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, Москва ***ГБОУ ВПО Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова
Минздравсоцразвития России, Москва Поступила в редакцию 29.11.2011 г. Принята к печати 25.12.2011 г.
Гиперандрогения — патологическое состояние, характеризующееся повышенным уровнем мужских половых гормонов (андрогенов) в организме женщины. Одной из основных причин гиперандроге-нии является аутосомно-рецессивное заболевание — врожденная гиперплазия коры надпочечников (ВГКН). Более 90% всех случаев этого заболевания возникает вследствие снижения под действием мутаций активности фермента 21-гидроксилазы, кодируемого геном СУР21А2. В данной работе проведено секвенирование полноразмерного гена СУР21А2 16 пациенток с ярко выраженными признаками гиперандрогении, которые предварительно были обследованы на наличие в гене СУР21А2 девяти наиболее распространенных мутаций, вызывающих ВГКН (7 точечных мутаций, а также де-леции размером 8 п.о. и ~30 т.п.о). В результате предварительного обследования у пациенток не был обнаружен генотип, который бы обеспечивал развитие патологического фенотипа. В ходе секвени-рования в гене обнаружено 26 однонуклеотидных полиморфизмов ($МР), из которых 25 были описаны в литературе (база данных ёЬЗМР, N061). При этом ген каждой пациентки обладал уникальным, только ей присущим сочетанием полиморфизмов. Новый SNP был локализован в З'-концевой части экзона 8 и представлял собой синонимическую замену С ^ Т. Выявленные SNP не распределены равномерно вдоль гена, а располагаются кластерами, в том числе в окрестностях инициирующего и терминирующего кодонов, а также вблизи границ интронов 2, 6 и 8. Высказано предположение, что сами по себе клинически нейтральные SNP в обнаруженных уникальных сочетаниях могут оказывать влияние на пространственную структуру мРНК гена СУР21А2 или на эффективность сплайсинга пре-мРНК и понижать уровень экспрессии гена, что могло бы приводить к развитию у пациенток наблюдаемого патологического фенотипа.
Ключевые слова: врожденная гиперплазия коры надпочечников, гиперандрогения, 21-гидроксилаза, СУР21А2, полиморфизм, 8ЫР, секвенирование ДНК, гаплотип.
ВВЕДЕНИЕ
Гиперандрогения представляет собой патологическое состояние, характеризующееся повышенным уровнем мужских половых гормонов (андрогенов) в организме женщины [1]. Одной из основных причин гиперандрогении является ауто-
Сокращения: ВГКН — врожденная гиперплазия коры надпочечников; ПЦР — полимеразная цепная реакция; п.о. — пары оснований; т.п.о. — тысячи пар оснований; SNP — од-нонуклеотидный полиморфизм (single nucleotide polymorphism); SNV — однонуклеотидная вариация (single nucleotide variation); NCBI — национальный центр биотехнологической информации (National Center for Biotechnology Information). #Автор для связи (тел./факс: (499) 793-46-11; эл. почта: abarannik@mx.ibch.ru).
сомно-рецессивное заболевание — врожденная гиперплазия коры надпочечников (ВГКН) [2—4]. Более 90% всех случаев этого заболевания возникает вследствие снижения под действием мутаций активности фермента 21-гидроксилазы (КФ 1.14.99.10), который является цитохромом Р450с21 и превращает прогестерон в 11-дезоксикортикостерон, а также 17-ОН-прогестерон в 11-дезоксикортизол [5]. Следствием понижения активности 21-гид-роксилазы являются недостаточность или отсутствие кортизола и альдостерона и чрезмерный синтез тестостерона в организме пациенток, что сопровождается развитием соответствующих фе-нотипических признаков. У человека 21-гидрок-
1F 2F 3F 4F 5F 6F 7F 8F
пДТТш!!! Ш
<р<р <р <р <р <= <=
7R 6R 5R 4R 3R 2R 1R
0.5 т.п.о.
Рис. 1. Стратегия определения первичной структуры гена СУР21Л2 человека. Геномную ДНК человека амплифициро-вали в ПЦР с праймерами и Ш, продукт ПЦР длиной ~3.3 т.п.н. после очистки секвенировали по двум цепям методом Сэнгера. Показана интрон-экзонная структура гена СУР21Л2 (экзоны — черные прямоугольники, обозначены номера экзонов), а также положение 5'-концов праймеров (незаостренные концы стрелок) в исследуемом гене. Стрелки указывают направление элонгации праймеров при секвенировании ДНК.
силазу кодирует ген CYP21A2, расположенный на хромосоме 6p21.3 в области главного комплекса гистосовместимости класса III [6, 7]. Расположенный по соседству псевдоген CYP21A1P, который на 98% гомологичен активному гену, как полагают, является источником многих мутаций, которые потенциально могут возникать в результате рекомбинации между CYP21A2 и CYP21A1P по механизму генной конверсии или неравного кроссинговера [8—11]. Наличие псевдогена кроме того затрудняет проведение молекулярно-генети-ческих исследований CYP21A2.
Ранее нами была разработана основанная на ПЦР в режиме реального времени система выявления в гене CYP21A2 восьми наиболее распространенных мутаций (7 точечных мутаций и деле-ция размером 8 п.о.), вызывающих ВГКН. С использованием этой системы была проведена ДНК-диагностика 43 пациенток с клиническими и биохимическими признаками гиперандрогении [12]. В результате были найдены только две гетерозиготные повреждающие мутации — нонсенс-мутация 318GlnX и миссенс-мутация V281L (по одной у двух разных пациенток). При этом гетерозиготное состояние обеих мутаций не могло обеспечивать развитие патологического фенотипа и не соответствовало клиническому диагнозу у этих пациенток.
Мы предположили, что у наших пациенток могут быть иные нарушения первичной структуры гена CYP21A2, которые приводят к появлению характерных симптомов заболевания. Для проверки этого предположения были полностью се-квенированы гены CYP21A2 у 16 пациенток из группы в 43 человека, ранее включенных в это исследование. Полученные результаты представлены в данной работе.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Стратегия секвенирования полноразмерного гена CYP21Л2
Высокая (98%) гомология между геном CYP21Л2 и прилегающим к нему псевдогеном CYP21Л1P не позволяет изучать ген 21-гидрокси-лазы, используя непосредственно геномную ДНК человека. Для решения этой проблемы в предыдущем исследовании мы разработали оригинальные локус-специфические праймеры 1Б и Ш (рис. 1), а также условия их применения, которые позволяют методом аллель-специфической ПЦР избирательно амплифицировать исследуемый ген, но не последовательности псевдогена [12]. Полученные таким образом продукты ПЦР, которые заключали в себе последовательности полноразмерного гена CYP21Л2, после очистки использовали для прямого секвенирования методом Сэнгера. Предварительно с использованием этих фрагментов ДНК в качестве матрицы у всех пациенток, включенных в исследование, определяли наличие девяти наиболее распространенных мутаций, вызывающих ВГКН (включая делецию размером ~30 т.п.о.). Для этого применяли метод аллель-специфической ПЦР в режиме реального времени, разработанный в нашей лаборатории и описанный в предыдущей работе [12]. Праймеры для секвенирования были подобраны таким образом, чтобы каждый участок анализируемого гена был секвенирован, по крайней мере, дважды по двум цепям ДНК. В результате для каждого клинического образца была установлена последовательность нуклеотидов гена CYP21Л2, а также части промоторной области (~100 п.о.) и части З'-концевой нетранслируемой области. Полная стратегия секвенирования гена CYP21Л2 представлена на рис. 1.
Таблица 1. Обнаруженные полиморфизмы, их положение в гене СУР21А2 и генотипы 16 обследованных пациенток
Номер SNP Положение SNP в гене Фенотип, источник мутации Генотипы пациенток Код SNP
Номер нуклеотида* Часть гена**
1 1706-1707 E-1 ins/del CTG ins/del-6 ins/ins-6 del/del-4
2 1793 E-1 syn C/T-3 T/T-13 C/C-0 rs33986168
3 1813 E-1 syn A/C-5 A/A-11 C/C-0 rs33947354
4 2073 I-2 C/T-3 T/T-12 C/C-1 rs6462
5 2097 I-2 A/C-5 C/C-10 A/A-1 rs6463
6 2131 I-2 C/T-2 T/T-13 C/C-1 rs6449
7 2272 I-2 P A/G-1 G/G-15 A/A-0 rs6450
8 2279 I-2 P A/C- 1 C/C-15 A/A-0 rs6451
9 2302 I-2 P A/G-3 G/G-13 A/A-0 rs59064806
10 2307 I-2 P G/T-3 G/G-13 T/T-0 rs6453
11 2311 I-2 P CA/GG-3 CA/CA-13 GG /GG -0 rs35147842
12 2361 E-3 K102R A/G-9 A/A-7 G/G-0 rs6474
13 2538 I-3 A/G-3 G/G -13 A/A-0 rs6466
14 3098 I-6 A/G-3 A/A-13 G/G-0 rs6458
15 3099 I-6 C/T-3 C/C-13 T/T-0 rs6459
16 3235 I-6 C/T-1 C/C-15 T/T-0 rs6465
17 3264 E-7 syn P C/G-4 C/C-12 G/G-0 rs6477
18 3323 E-7 S269T C/G-2 G/G-13 C/C-0 rs6472
19 3361 E-7 V281L*** G/T-1 G/G-15 T/T-0 rs41315836
20 3672 E-8 non Q318X**** C/T-1 C/C-15 T/T-0 rs7755898
21 3793 E-8 syn C/T-1 C/C-15 T/T-0 new
22 3925 E-9 syn C/T-2 C/C-14 T/T-0 rs6469
23 4369 E-10 syn A/G-5 A/A-6 G/G-5 rs6446
24 4377 E10 S494N A/G-5 A/A-6 G/G-5 rs6473
25 4397 E10 3'UTR A/G-2 G/G-14 A/A-0 rs6447
26 4436 E10 3'UTR C/T- 8 C/C-7 T/T-1 rs1058152
* Нумерация нуклеотидов начинается с первого нуклеотида референсной последовательности (GenBank M12792.1), нук-леотид A инициаторного ATG-кодона гена CYP21A2 находится в положении 1679.
** Использованные обозначения: E — экзон, I — интрон (указаны их номера); 3'UTR — З'-концевая нетранслируемая область; non — нонсенс-мутация, ins — вставка, del — делеция, syn — синонимическая замена; указаны соответствующие замены аминокислотных остатков; P — аналогичная замена нуклеотида имеется в псевдогене CYP21A1P; new — SNV, обнаруженный в данной работе.
*** Мутация, ассоциированная с неклассической формой ВГКН.
**** Мутация, ассоциированная с классической формой ВГКН.
Первичная структура гена СУР21А2 уникальна у каждой из обследованных пациенток
Анализ исследованных нуклеотидных последовательностей полноразмерного гена СУР
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.