МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2014, том 48, № 2, с. 344-348
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
УДК 578.23,57.085.23
УНИВЕРСАЛЬНАЯ МОДУЛЬНАЯ СИСТЕМА СКРИНИНГА in vitro ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ ИНГИБИТОРОВ РЕПЛИКАЦИИ ВИЧ-1
© 2014 г. М. М. Прокофьева1, Н. Н. Орлова1,2, А. С. Горностаева1,2, А. А. Шульгин1,2, Н. А. Никитенко1, В. Н. Сенченко1, Т. Д. Лебедев1, П. В. Спирин1, K. Riecken3, B. Fehse3,
C. Stocking4, В. С. Прасолов12*
Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, Москва, 119991 Россия 2Московский физико-технический институт (государственный университет), Долгопрудный, Московская обл., 141700 Россия 3University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Research Dept. Cell & Gene Therapy, D-20246 Hamburg, Germany 4Heinrich-Pette-Institute for Experimental Virology and Immunology, Hamburg, D-20251 Germany
Поступила в редакцию 09.10.2013 г. Принята к печати 14.10.2013 г.
Описана система безопасного скрининга потенциальных лекарственных средств против ВИЧ-1, основанная на рекомбинантных лентивирусных векторах. Система позволяет оценить ингибиторную активность соединений в отношении обратной транскриптазы и интегразы как дикого типа, так и мутантных форм, соответствующих лекарственно-устойчивым формам ВИЧ-1. Система может использоваться для поиска эффективных ингибиторов проникновения ВИЧ-1 в клетку и факторов, необходимых для формирования и созревания частиц на последних стадиях жизненного цикла вируса.
Ключевые слова: ВИЧ-1, псевдо-ВИЧ-1-частицы, обратная транскриптаза, нуклеозидные ингибиторы, ненуклеозидные ингибиторы, ингибиторы интегразы, сульфатированные полисахариды.
UNIVERSAL MODULAR SYSTEM FOR in vitro SCREENING OF POTENTIAL INHIBITORS OF HIV-1 REPLICATION, by M. M. Prokofjeva1, N. N. Orlova12, A. S. Gornostaeva12, A. A. Shulgin12, N. A. Nikitenko1, V. N. Senchenko1, T. D. Lebedev1, K. Riecken3, B. Fehse3, C. Stocking4, P. V. Spirin\ V. S. Prassolov1,2* (1Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences, Moscow, 119991 Russia; *e-mail: prassolov45@mail.ru; 2Moscow Institute of Physics and Technology (State University), Dolgoprudny, Moscow Region, 141700 Russia; 3University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Research Dept. Cell & Gene Therapy; D-20246 Hamburg, Germany; 4Heinrich-Pette-Institute for Experimental Virology and Immunology, Hamburg, D-20251 Germany). Here we describe a system based on recombinant lentiviral vectors for the safe screening of potential anti-HIV drugs. The system allows to evaluate the sensitivity of HIV-1 reverse transcriptase and integrase (wild-type as well as mutant forms of these enzymes detected in drug-resistant virus isolates) towards different drugs and substances, but also to screen inhibitors of other stages of HIV-1 life cycle.
Keywords: HIV, pseudo-HIV-1 particles, reverse transcriptase, nucleoside inhibitors, non-nucleoside inhibitors, integrase inhibitors, sulfated polysaccharides.
DOI: 10.7868/S0026898414020153
Вирус иммунодефицита человека первого типа (ВИЧ-1), относящийся к роду (подсемейству) лен-тивирусов семейства ретровирусов, является возбудителем одного из широко распространенных и опасных социально-значимых заболеваний — синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД).
ВИЧ-1 был выделен в лабораториях Л. Монта-нье и Р. Галло 30 лет назад [1, 2], однако эффективная вакцина против этого вируса до сих пор не создана.
* Эл. почта: prassolov45@mail.ru
Согласно данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) число ВИЧ-1-инфицирован-ных к 2013 году составляет около 40000000. В Российской Федерации зарегистрировано около 900000 инфицированных этим вирусом. Из прогнозов ВОЗ и ряда других организаций следует, что даже при выполнении всех инициатив по контролю за распространением СПИДа и применении анти-ВИЧ-терапии число ВИЧ-1-инфицированных может приблизиться к 50000000.
Вместе с тем следует отметить, что благодаря одновременному применению нескольких соединений — ингибиторов/блокаторов ключевых этапов жизненного цикла ВИЧ-1 (так называемая высокоактивная антиретровирусная терапия, ВААРТ или комбинированная антиретровирусная терапия, кАРТ) СПИД из фатального смертельного заболевания перешел в категорию тяжелых хронических заболеваний. В настоящее время при ВААРТ применяются более 25 соединений, относящихся к различным классам противовирусных агентов [3].
Несмотря на значительный прогресс в области антиретровирусной терапии, крайне важной и остается разработка новых анти-ВИЧ-1-пре-паратов. Основные причины этого заключаются в следующем.
1) Для ВИЧ-1 характерна чрезвычайно высокая частота приобретения (накопления) адаптивных мутаций. Большинство ВИЧ-1-инфицированных являются носителями нескольких мутантных форм вируса, устойчивых, по крайней мере, к одному из соединений, используемых в терапии ВИЧ-1-инфекции. Более того, подобные резистентные формы вируса могут передаваться от индивида к индивиду. Это уже привело к тому, что в настоящий момент в США и Европе примерно у 10% больных, никогда не получавших лечения, выявляют формы вируса, невосприимчивые к одному или даже ко всем классам анти-ВИЧ-1-пре-паратов.
2) Поскольку ВААРТ не обеспечивает полного уничтожения ВИЧ-1 в организме, а только значительно снижает титр вируса в крови, больные вынуждены принимать одновременно несколько анти-ВИЧ-1-препаратов всю свою жизнь. Любое анти-ВИЧ-1-соединение и, потенциально, комбинации таких соединений, оказывают кратковременное токсическое действие, поэтому их длительной прием часто приводит к развитию серьезных долговременных побочных эффектов, таких как нарушение функций печени и почек. Все это вызывает общее ухудшение состояния больного и отказ от приема неоходимых лекарственных препаратов, что, в свою очередь, увеличивает риск появления у него новых мутантных форм вируса.
Важный этап в процессе разработки антиретро-вирусных препаратов — проверка их эффективности. В настоящее время для тестирования потенциальных ингибиторов/блокаторов ВИЧ-1 применяют два подхода. Первый основан на определении ингибиторной активности тестируемых соединений по отношению к одному из очищенных реком-бинантных ферментов ВИЧ-1 (обратная тран-скриптаза, интеграза или протеаза). Очевидно, что результаты, получаемые при этом, представляют интерес для определения молекулярных особенностей (свойств) данных ферментов, но не позво-
ляют установить такие важные для потенциального лекарственного (терапевтического) средства параметры (свойства), как цитотоксичность, способность проникать в клетки, стабильность, возможность подвергаться разного рода превращениям, например, фосфорилированию, как в случае нуклеозидных ингибиторов обратной транскрипта-зы. Второй подход — тестирование ингибиторной активности в системе инфекционный репликаци-онно-компетентный ВИЧ-1—чувствительные клетки. Этот подход лишен недостатков, присущих методам, основанным на использовании очищенных ферментов. Однако большинство лабораторий, занятых поиском новых анти-ВИЧ-1-соединений, не имеют возможности работать непосредственно с инфекционным репликационно-компетентным вирусом. Исследования такого рода, включающие работу с природным вирусом, могут проводиться только в сертифицированных лабораториях, гарантирующих безопасность персонала и имеющих разрешение на работу с инфекционными материалами третьего класса биологической опасности. При этом существенное препятствие представляет ограничение или полный запрет на работу с постоянно возникающими лекарственно-устойчивыми формами ВИЧ-1, нечувствительными к существующим лекарственным средствам.
В настоящее время именно поиск эффективных ингибиторов лекарственно-устойчивых форм вируса представляет первоочередную задачу. В связи с этим разработка и использование безопасных клеточных систем для определения противовирусной активности весьма важны для создания новых лекарственных средств.
Нами разработана безопасная модульная экспресс-система скрининга потенциальных ингиби-торов/блокаторов репликации ВИЧ-1, в которой применены рекомбинантные лентивирусные векторы, сконструированные на основе генома ВИЧ-1. Векторы способны эффективно осуществлять перенос и экспрессию маркерных генов флуоресцентных белков в трансдуцированных клетках-мишенях. Функциональная эффективность таких лентивирусных векторов (псевдо-ВИЧ-1-частиц), т.е. способность переносить маркерный ген в клетки-мишени, проявляется как в результате активности всех ферментов ВИЧ-1 (обратная транскрипта-за, интеграза, протеаза), ответственных за прохождение внутриклеточных этапов жизненного цикла и созревание капсидных белков вируса, так и белков оболочки, обеспечивающих самые первые этапы взаимодействия вируса с чувствительными клетками при заражении, а именно, прикрепление вирусной частицы к поверхности клетки-мишени и проникновение капсида в клетку.
Поэтому эффективность ингибитора/блокато-ра любого из этапов жизненного цикла ВИЧ-1 можно количественно измерить путем цитофлуо-
346
ПРОКОФЬЕВА и др.
ВИЧ-1
Вектор LeGO
Рис. 1. Схематическое изображение генома провируса ВИЧ-1 (вверху) и рекомбинантного генома провируса псевдо-ВИЧ-1-частиц (внизу). Обозначения: LTR — длинный концевой повтор, gag — ген, кодирующий структурные белки (MA — матриксный белок, CA — капсидный белок, NC — белок нуклеокапсида), pol — ген, кодирующий вирусные ферменты (PR — протеаза, RT — обратная транскриптаза, IN — интеграза), env — ген белка оболочки ВИЧ-1 (SU — поверхностная субъединица gp120, TM — трансмембранная субъединица gp41), vif, vpr, vpu, ref, tat, nef — гены вспомогательных вирусных белков, eGFP — ген зеленого флуоресцентного белка, Y — сигнал упаковки, wPRE — посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурка, SFFV — используемый в качестве внутреннего промотора U3 промотор из LTR вируса, вызывающего образование фокусов на клетках селезенки.
eGFP
риметрии или с помощью флуоресцентного микроскопа, так как подавление активности любого из перечисленных вирусспецифических белков приводит, в конечном счете, к уменьшению числа трансдуцированных флуоресцирующих клеток-мишеней.
Используемый в системе рек
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.