ОБЗОРЫ =
УДК 577.2150
УНИВЕРСАЛЬНЫЙ КЛЕТОЧНЫЙ ПЕРЕКЛЮЧАТЕЛЬ RAS И ЕГО РОЛЬ В РАЗВИТИИ ДРОЗОФИЛЫ
© 2013 г. В. Г. Митрофанов, А. И. Чекунова, П. А. Прошаков, М. И. Барсуков*
Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, 119334 Москва, ул. Вавилова, 26 *Московский Государственный Педагогический Университет, Биолого-химический факультет
129164 Москва, ул. Кибальчича, 6 E-mai: vgmitro1936@mail.ru Поступила в редакцию 23.03.12 г.
Окончательный вариант получен 05.02.13 г.
Гены семейства Ras впервые были идентифицированы в 1960-х годах как трансформирующие онкогены, которые вызывали опухоли у крыс при заражении вирусамии саркомы Harvey и Kirsten (он-когены-Ha-ras и Ki-ras соответственно). Позже трансформирующие гены ras были открыты в раковых клетках человека. Последующие исследования клеток нейробластомы привели к открытию третьего гена ras у человека, названного N-ras. Продукты генов Ras-семейства играют важную роль в процессах клеточной пролиферации и дифференцировки и находятся под контролем рецептор-ных тирозинкиназ. Использование дрозофилы как модели позволило с успехом применять генетический анализ в исследованиях функций генов ras. У D. melanogaster с помощью пробы v-Ha ras выявлено 3 полосы на препаратах политенных хромосом. Все три полосы (Dras1, Dras2, Dras3) расположены в дисках 85D, 64B, 62B хромосомы 3 по карте Бриджеса. Из них только ген Dras1 имеет общее происхождение с генами ras млекопитающих. Несмотря на многочисленные работы по изучению роли генов ras в развитии насекомых, данный вопрос изучен недостаточно. Не так много внимания в литературе уделяется роли изменчивости генов ras в эволюции. В настоящее время активно идентифицируются мишени Ras-белков, изучаются сигнальные пути с их участием, а также последствия воздействий на эти пути в тканях дрозофилы, в клетках дрожжей и млекопитающих. Обсуждаются функции белка Ras в сигнальных путях, контролирующих проявление мутаций в морфогенезе дрозофилы и связь гена ras с фенотипическими признаками опухоли.
Ключевые слова: семейство Ras-белков, гены ras, онтогенез, Drosophila.
DOI: 10.7868/S0475145013040083
ВВЕДЕНИЕ
Белки Ras являются членами высоко консервативного семейства ГТФазных белков, которые функционируют в путях сигнальной трансдукции у широкого ряда организмов и в процессах развития (Bogulski, 1998). Среди различных ГТФ/ГДФ связывающих белков особое место занимают продукты семейства генов ras. Белки семейства Ras относятся к малым G-белкам или малым ГТФазам, которые играют роль "молекулярных переключателей" (Valencia et al., 1991; Rommel et al., 1998; Rojas et al., 2012). Белки семейства Ras участвуют в передаче сигнала от мембранных рецепторов и регулируют процессы клеточного деления, прикрепления их к внеклеточному матриксу, а также влияют на состояние актинового цитоскелета и на злокачественную трансформацию. Белки Ras являются компонентами различных каскадов передачи сигнала (рис. 1). Наиболее изученным явля-
ется MAP-киназный каскад (с участием протеин-киназ, активируемых митогенами). Активация и инактивация Ras обеспечиваются двумя специфическими белками. Фактор GEF (guanine-nucleotide exchange factor) осуществляет обмен ГДФ на ГТФ в активном центре белка Ras, в результате чего Ras-белок переходит из неактивного состояния в активное. GAP (GTPase-accelerating protein) взаимодействует с Ras и повышает его ГТФазную активность. После дефосфорилирования ГТФ Ras инак-тивируется.
Структурно-функциональное исследование показало, что N-конец, консервативный у всех белков Ras, ответственен за активацию мишеней Ras. Очевидно различные белки Ras стимулируются разными сигналами, но последовательно активируют одни и те же мишени внутри клетки. В клетках млекопитающих трансформирующая функция Ras тесно связана с их способностью
Тирозин-киназные рецепторы: EGF, IGF, NGF, SEV, TORSO, Le23.
Цитоплазматическая мембрана
Клеточная
пролиферация,
дифференцировка
Ингибирование апоптоза, регуляция цитоскелета перестройка цитоскелета
Рис. 1. Схема регуляции клеточных процессов с участием Ras-белка. Упрощенная модель передачи сигнала от активированного тирозин-киназного рецептора через промежуточный белок Grb2, активирующий SOS, который, в свою очередь, активирует Ras, заменяя ГДФ на ГТФ. Активированный Ras запускает ряд каскадов, включающих белки PI(3)K, RAF, RalGDS и другие, что приводит к активации широкого спектра клеточных процессов.
прикрепляться к плазматической мембране. Представители семейства Ras имеют на С-конце сигнальную последовательность cys-A-A-X (где А — любая алифатическая аминокислота, Х — терминальная аминокислота), потеря которой, как показал Виллумсен с соавторами на примере v-Ha-ras (Willumsen et al., 1984, 1985), предотвращает прикрепление белка к мембране и снижает его трансформирующий потенциал. Функция Ras-обусловленных путей сигнальной трансдукции (Ras-сигналинг) заключается в контроле клеточной пролиферации и дифференцировки (Lowy et al., 1993, Moodie et al., 1994). ГТФазная активность Ras контролируется РТК рецепторными ти-розинкиназами (Schlessinger, 1993; van der Geer etal., 1994).
Для того чтобы ген ras функционировал как онкоген, в локусе должны произойти определенные мутации, в результате которых ген активируется. Мутационно активированные гены ras обнаружены примерно у 30% всех случаев рака у человека (Reuveni et al., 2003). Разные точковые мутации в одном и том же кодоне могут активировать этот ген (Capon et al., 1983).
Анализ организации и последовательностей двух локусов (c-Ki-ras1 и c-Ki-ras2) у человека, родственных трансформирующему гену вируса мышиной саркомы Кирстена показал, что один из них является функциональным геном, а другой — псевдогеном. Два финальных кодирующих экзона функционального гена, вероятно, возникли с помощью дупликации. Очевидно, функциональный ген может специфицировать любой из двух родственных полипептидов в процессе РНК-сплайсинга (McGrath et al., 1983). ГТФазная активность может избирательно нарушаться мутацией, что приводит к активации онкогенного потенциала (McGrath et al., 1983, 1983a).
Исследования на дрозофиле дали возможность применять генетический анализ в исследованиях функций гена ras. Сначала три члена семейства онкогенов ras были идентифицированы только у позвоночных. У D. melanogaster с помощью пробы v-Ha ras выявлено три полосы на препаратах поли-тенных хромосом. Все три полосы, соответствующие генам (Drasl, Dras2, Dras3) расположены в дисках 85D, 64B, 62B хромосомы 3 по карте Бри-
универсальный клеточный переключатель ras
Схема гена Drasl Drosophila melanogaster
333
^В Нетранслируемые районы (5', 3'-UTR) I I Кодирующая часть гена
Рис. 2. Схема гена Drasl Drosophila melanogaster.
джеса (Shilo, Weinberg, 1981; Neuman-Silberberg etal., 1984).
Три гена ras Drosophila имеют низкий уровень гомологии между собой. Ген Drasl кодирует белок р21, который состоит из двух доменов. N-конце-вой домен белка Ras дрозофилы является функциональным и сохраняет гомологию с другими белками семейства Ras (Neuman-Silberberg et al., 1984). Drasl кодирует один основной транскрипт длиной 2.0 т.п.о., в то время как Dras2 имеет три сплайс-варианта (1.6, 2.1, 2.6 т.п.о.). Drasl утратил последовательность ТАТА-бокса, но содержит элементы транкрипционного регулятора DRE (DNA replication-related element), представленного па-линдромной последовательностью TATCGATA и необходимого для связывания фактора DREF (Hi-rose et al., 1993).
Drasl кодирует белок, гомологичный белку Haras млекопитающих на 75% (Neuman-Silberberg etal., 1984). Степень гомологии трех Ras-белков млекопитающих составляет между собой 80% (Fasano et al., 1984). При этом в пределах данной группы наибольшее сходство наблюдается в отношении фрагмента, соответствующего первым 120 аминокислотным остаткам, где степень гомологии составляет 97% (Fasano et al., 1984; Ogura et al., 2009; Rojas et al., 2012). Drasl D. melanogaster является структурным и функциональным аналогом генов ras млекопитающих (рис. 2). Транскрипт гена составляет 1958 п.о. Его трансляция приводит к образованию полипептида длиной 189 аминокислотных остатков. (Neuman-Silberberg et al., 1984; Schejiter et al., 1985).
Степень гомологии гена Dras2 и c Ha-ras млекопитающих меньше и составляет 50%. На N-конце белок Dras2 содержит один дополнительный аминокислотный остаток по сравнению с Drasl и 4 дополнительных аминокислотных остатка по сравнению с Rasl дрожжей (Mozer et al., 1985). В отличие от них промотор Dras2 имеет два вырожденных GC-бокса и ТАТА-подобные последовательности. Промотор Dras2 у D. melanogaster двунаправленный и регулирует еще один ген, ориентированный в противоположном направлении (Cohen et al., 1988). Эти два совместно транскрибируемых гена разделены только 93 основаниями. Делеционный анализ показал, что для транскрипционной актив-
ности обоих генов требуется общий цис-действую-щий элемент в пределах данного промотора (Salzberg et al., 1993).
Ген Dras3 дрозофилы не имеет интронов (Karim et al., 1996) и кодирует белок, гомологичный с-На-ras млекопитающих на 48% и с-Ki-ras на 56% (Schejiter et al., 1985). Наибольшая гомология так же, как и у двух других ras-генов дрозофилы, наблюдается в области, соответствующей N-концу белка. Согласно гипотезе Пауэрса с соавторами (Powers et al., 1984), эти эволюционно консервативные участки обеспечивают функциональную активность белков данного семейства.
Dras-гены у дрозофилы имеют длинные нетранслируемые 5'- или 3'-районы (Brock, 1987). Анализ последовательностей 27 аллелей каждого из 3 генов, родственных ras, показал, что все они имеют низкий уровень полиморфизма. Отсутствие аминокислотных замещений в последовательностях гена Drasl у D. melanogaster и у видов-двойников D. simulans и D. mauritiana свидетельствует о высокой функциональной значимости. Ген Drasl имеет наименьшую внутривидовую изменчивость относительно величины дивергенции от видов-двойников в сравнении с Dras2 (Gasperini, Gibb-son, 1999).
Изменения дозы генов Dras у дрозофилы не имеют фенотипического эффекта, но потеря функции аллелей Drasl и
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.