РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2011, том 51, № 2, с. 258-263
-- УФ-ОБЛУЧЕНИЕ
УДК [57+61]::539.1.04::614.875:612.112.94
УРОВЕНЬ ЭКСПРЕССИИ МОЛЕКУЛ РЕЦЕПТОРНОГО КОМПЛЕКСА Т-ЛИМФОЦИТАМИ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА В УСЛОВИЯХ ИХ УФ-ОБЛУЧЕНИЯ
© 2011 г. В. Г. Артюхов1*, О. В. Путинцева1, В. А. Вдовина1, И. А. Колтаков1,
М. В. Пашков2, Д. В. Василенко2
1ГОУВПО "Воронежский государственный университет", Воронеж 2 Воронежская государственная медицинская академия им. Н.Н. Бурденко, Воронеж
С помощью методов проточной цитофлуориметрии и непрямого твердофазного иммунофермент-ного анализа изучено влияние широкого диапазона доз УФ-излучения (240—390 нм) на уровень экспрессии молекул рецепторного комплекса (CD3, CD4, CD8 маркеров) на поверхности мембран Т-лимфоцитов крови человека. Установлено, что УФ-свет в малых и средних дозах (151, 453 и 906 Дж/м2) оказывает однонаправленное (активирующее) действие на экспрессию молекул рецепторного комплекса, а в большой дозе (1359 Дж/м2) может как повышать (CD4 и CD8 маркеры), так и снижать (CD3 комплексы) количество анализируемых молекул на поверхности мембран Т-клеток.
УФ-излучение, Т-лимфоциты, Т-клеточный рецептор, CD3 комплекс, корецепторы CD4 и CD8.
Т-лимфоциты обладают уникальной способностью распознавать собственные и чужеродные антигены и отвечать активацией на контакт c ними за счет наличия на поверхности их мембран специального антигенраспознающего комплекса, образованного Т-клеточным рецептором (TCR-CD3) и костимулирующими молекулами CD4 и CD8 [1, 2].
В настоящее время структура и функции названных выше маркеров достаточно хорошо изучены. Т-клеточный рецептор (TCR) представляет собой гетеродимер, образованный а- и ß- или у- и 5- цепями и ассоциированный на поверхности мембраны с полипептидным комплексом CD3. Основными функциями CD3 комплекса являются обеспечение проведения активационного сигнала от TCR внутрь клетки и регуляция экспрессии TCR на поверхности мембран лимфоцитов [1, 3, 4]. Ассоциат TCR-CD3 способен распознавать антиген-пептид, связанный с молекулами главного комплекса гистосовместимости (МНС I или II класса) на поверхности вспомогательных анти-генпрезентирующих клеток или любых клеток-мишеней организма. Эффективность такого распознавания обеспечивается корецепторными молекулами CD4 и CD8, обладающими сродством к молекулам МНС II/I класса и экспрессируемыми Т-хелперами и цитотоксическими Т-лимфоцита-ми соответственно [5—8].
* Адресат для корреспонденции: 394006 Воронеж, Университетская пл., 1, ГОУ ВПО ВГУ; тел.: (4732) 20-89-81, (4732) 20-85-86; факс: (4732) 20-83-08; e-mail: avg@ main.vsu.ru.
Для нормального протекания иммунного ответа в организме необходима сбалансированная активность взаимодействующих иммунорегуля-торных клеток. При различных патологических состояниях (аутоиммунные и аллергические заболевания, иммунодефициты, гепатиты различного вида, злокачественные опухоли и др.) меняется поверхностный фенотип иммунокомпетент-ных клеток, количественный и качественный состав их субпопуляций, иммунорегуляторный индекс СВ4/СЭ8. В любом случае, при развитии дисбаланса в количестве или активности СЭ4+ и СЭ8+ клеток, механизмы регуляции иммунного ответа нарушаются [9—12].
Для коррекции нарушений в работе иммунной системы больных с различными типами патологий в современной клинической практике широко применяется метод аутотрансфузии УФ-облу-ченной крови (АУФОК-терапии). К настоящему времени установлено, что АУФОК сопровождается активацией иммунных процессов и улучшением иммунологического статуса организма, что может быть следствием структурно--функциональных изменений иммунокомпетентных клеток крови после их фотомодификации. Выявлено, что облучение УФ-светом в терапевтических дозах индуцирует структурные изменения поверхности клеток крови, шеддинг надмембран-ных компонентов, демаскировку мембранных маркеров, изменение мембранозависимых свойств и функций клеток и их активацию [13— 15]. Известно, что УФ-свет оказывает влияние на антигенный профиль мембран Т- и В-лимфоци-тов, изменяя уровень экспрессии некоторых по-
верхностных антигенов и рецепторов [16, 17]. Однако механизмы иммуностимулирующего действия АУФОК-терапии, связанные с состоянием CD3, СЭ4 и СЭ8 — клеточных маркеров, остаются до конца не выясненными и требуют дальнейшего изучения.
В связи с этим исследовалось влияние УФ-све-та (240—390 нм) в дозах 151—1359 Дж/м2 на субпо-пуляционный состав Т-лимфоцитов крови человека и уровень экспрессии молекул их рецептор-ного комплекса (CD3, CD4, CD8 маркеров) на поверхности мембран.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
Лимфоциты выделяли из периферической крови доноров методом седиментации в градиенте плотности фиколл-урографина (р = 1.077 г/см3). Суспензию обогащенных Т-клеток получали, используя колонки, заполненные синтетической ватой. Метод основан на различной степени адгезии лимфоцитов на волокнах синтетической нейлоновой ваты [18]. Состав клеточных суспензий лимфоцитов человека согласно данным, полученным ранее на кафедре биофизики и биотехнологии ГОУ ВПО "Воронежского госуниверситета" [19], до разделения на колонках с синтетической ватой: 65 ± 5% Т-лимфоцитов и 17 ± 4% В-лимфоцитов, после разделения — в Т-клеточной суспензии: 87 ± 3% Т-лимфоцитов и 4 ± 2% В-клеток.
Эксперименты проводили с суспензией обогащенных Т-клеток и со смесью Т- и В-лимфоци-тов. Облучение суспензий клеток проводили светом ртутно-кварцевой лампы типа ДРТ-400 через светофильтр УФС-1 с полосой пропускания 240— 390 нм в термостатируемой (37°С) стеклянной кювете при постоянном перемешивании. Интенсивность облучения составляла 151 Дж/м2 в минуту на расстоянии 0.23 м от объекта. Время экспозиции составило 1, 3, 6 и 9 мин, что соответствовало дозам облучения 151, 453, 906 и 1359 Дж/м2.
УФ-облученные лимфоциты инкубировали в среде RPMI 1640, с добавлением L-глутамина — 1%, р-меркаптоэтанола ("Sigma", США) — 5 х 10-5 моль/л, HEPES ("Serva", Германия), эмбриональной телячьей сыворотки — 10%. Инкубацию осуществляли в течение 24 ч при 37°С и 5%-ной атмосфере СО2.
Для определения уровня экспрессии изучаемых маркеров на поверхности мембран нативных и фотомодифицированных Т-лимфоцитов после суточной инкубации применяли методы непрямого твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) и проточной цитофлуориметрии.
При проведении ИФА в работе использовали суспензию обогащенных Т-клеток, монокло-нальные антитела серии LT3, LT4, LT8 и коньюгат козьих антител против IgG, меченных пероксида-
зой хрена (ООО "Сорбент", Москва). В качестве субстрата для пероксидазы использовали раствор 3,3',5,5' тетраметилбензидина в 0.15 моль/л цит-ратно-ацетатном буфере (рН 5.0). Результаты экспериментов регистрировали спектрофотомет-рически при длине волны 450 нм на вертикальном фотометре "Униплан" (Пикон, Москва) и выражали в единицах оптической плотности (опт. ед.).
При использовании метода проточной цито-флуориметрии суспензию Т- и В-лимфоцитов анализировали на проточном цитометре "CyFlow space" ("Partee") с использованием моноклональ-ных антител LT3, LT4, LT8, меченных ФИТЦ (ООО "Сорбент", Москва) и IgG-FITC, в качестве изотипического контроля. Интенсивность флуоресценции клеток коррелирует с плотностью антигенов на клеточной поверхности. По величине средней интенсивности флуоресценции (СИФ) клеток после взаимодействия со специфическим антителами, меченными флуорофо-ром, судили об уровне экспрессии изучаемых молекул после УФ-облучения и результаты выражали в процентах, рассчитывая по формуле:
С И Ф о бр азе ц - СИФ
изотип-
контроль х100 %
СИФ
А ^ контроле
где СИФобразец — СИФ фотомодифицированных образцов, СИФизотип-контроль - СИФ изотипиче-ского контроля, СИФконтроль — СИФ необлучен-ных клеток.
Статистическую обработку результатов экспериментов проводили с помощью прикладных программ '^а^Иеа 6.0". Достоверность различий контрольных и опытных значений сравниваемых показателей определяли по ¿-критерию Стьюдента. При этом рассчитывали степень варьирования показателя при повторных определениях внутри опыта.
РЕЗУЛЬТАТЫ
По данным иммуноферментного анализа уровень экспрессии СЭ3 комплексов на поверхности мембран нативных Т-клеток составил 0.203 ± 0.003 опт. ед. (рис. 1). После облучения Т-лимфоцитов УФ-светом в дозах 151, 453 и 906 Дж/м2 уровень экспрессии СЭ3 комплексов повышался на 16, 14 и 18% соответственно по отношению к контролю. Воздействие УФ-света в максимальной из используемых нами доз облучения (1359 Дж/м2) на Т-клетки доноров снижало количество изучаемых мембранных молекул на 14%.
Уровень экспрессии СЭ4 маркеров на поверхности мембран нативных Т-клеток в среднем составил 0.203 ± 0.008 опт. ед. (рис. 1). Было выявлено, что УФ-свет во всем используемом нами диа-
260
АРТЮХОВ и др.
Рис. 1. Изменение уровня экспрессии CD3 комплексов (1), корецепторов CD4 (2) и CD8 (3) Т-лимфоцитами после действия УФ-излучения (по данным иммуноферментного анализа).
пазоне доз (151—1359 Дж/м2) вызывает увеличение уровня экспрессии CD4 рецепторов на 19—35% по сравнению с контролем.
Уровень экспрессии CD8 рецепторов на поверхности мембран нативных Т-лимфоцитов в среднем составил 0.202 ± 0.011 опт. ед. (рис. 1). Воздействие УФ-излучения в диапазоне доз 151— 1359 Дж/м2 на Т-клетки усиливает экспрессию исследуемого показателя: наблюдается постепенное повышение уровня экспрессии CD8 маркеров на 23—56% по сравнению с немодифициро-ванными клетками.
Для подтверждения результатов, полученных с помощью метода твердофазного иммунофер-ментного анализа, при исследовании влияния УФ-света на уровень экспрессии CD3 комплексов, CD4, CD8 рецепторов на поверхности Т-лимфоцитов крови человека, были проведены эксперименты по изучению субпопуляционного состава лимфоцитов и уровня экспрессии изучаемых маркеров на поверхности нативных и фото-модифицированных клеток методом проточной цитофлуориметрии.
Субпопуляционный состав нативных Т-лим-фоцитов включал в себя 76 ± 4% CD3+ клеток, 43 ± 2% CD4+ лимфоцитов, 23 ± 4% CD8+ клеток и не изменялся после воздействия на смесь имму-нокомпетентных клеток УФ-света в дозах 151— 1359 Дж/м2.
Анализ уровня эк
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.