УДК 574::539.1.04:577.123:595.1:58.051:614.876
УРОВЕНЬ ПОВРЕЖДЕНИЙ И СКОРОСТЬ РЕПАРАЦИИ ДНК В КЛЕТКАХ ДОЖДЕВЫХ ЧЕРВЕЙ ИЗ ПОПУЛЯЦИЙ, ДЛИТЕЛЬНОЕ ВРЕМЯ ОБИТАЮЩИХ В ПОЧВЕ С ПОВЫШЕННЫМ СОДЕРЖАНИЕМ
РАДИОНУКЛИДОВ
© 2015 г. А. В. Канева12, Е. С. Белых1, Т. А. Майстренко1, Д. М. Шадрин12, Я. И. Пылина1,2, И. О. Велегжанинов1,2, *
Институт биологии Коми НЦ УрО РАН, Сыктывкар 2Сыктывкарский государственный университет
Проблеме изучения влияния малых доз ионизирующих излучений и химических токсических агентов на биологические системы на различных уровнях организации посвящено большое число научных исследований. В то же время крайне мало экспериментальных данных, позволяющих выявить молекулярно-клеточные механизмы адаптации животных и растительных объектов из природных популяций к неблагоприятному воздействию факторов окружающей среды. Целью настоящего исследования была оценка генотоксических эффектов у дождевых червей Aporrectodea caliginosa Sa-vigny и Lumbricus rubellus Hoff. из популяций, в течение многих поколений заселяющих территории с техногенно повышенным содержанием в почвах тяжелых естественных радионуклидов и тяжелых металлов. Установлено, что детектируемые с помощью щелочной и нейтральной версии метода ДНК-комет уровни повреждения ДНК беспозвоночных, длительное время обитающих на загрязненных территориях, не отличаются от спонтанного уровня таких нарушений у животных из контрольной популяции. В то же время скорость репарации повреждений ДНК, индуцированных в клетках особей A. caliginosa с загрязненной территории дополнительным острым облучением в дозе 4 Гр, была значительно выше, чем для червей с контрольных участков.
Загрязнение почвы, дождевые черви, природные популяции, повреждение ДНК, скорость репарации ДНК.
DOI: 10.7868/S0869803115010051
Антропогенное загрязнение Земного шара в настоящее время приобрело глобальный характер и имеет тенденцию к расширению масштабов и спектра загрязняющих факторов. По современным данным масса ежегодно поступающих загрязняющих веществ в окружающую среду увеличивается на 4% [1]. При этом на большей части загрязненных территорий биологические системы испытывают хроническое воздействие агентов химической и физической природы, которое можно охарактеризовать как низкодозовое. Проблеме изучения влияния на биологические объекты малых доз как ионизирующих излучений, так и химических токсикантов посвящено большое число научных исследований. В то же время механизмы формирования таких специфических эффектов низкодозового воздействия как горме-зис, адаптивный ответ или гиперчувствительность на всех уровнях структурно-функциональной организации окончательно не выяснены [2—
* Адресат для корреспонденции: Республика Коми, 167982 Сыктывкар, ул. Коммунистическая, 28; тел.: (8212) 43-19-69; факс: (8212) 24-01-63; e-mail: vellio@yandex.ru
6]. Еще меньше экспериментальных данных о реакции биоты на хроническое действие генотоксических факторов [7—9]. Практически отсутствует в научной литературе информация о молекуляр-но-клеточных механизмах адаптации, являющихся, по всей видимости, одной из основ устойчивого существования природных популяций растений и животных в условиях сильнейшего антропогенного давления на окружающую среду. Мы предполагаем, что исследования дождевых червей семейства ЬытЬгМйаг из природных популяций, населяющих загрязненные в результате работы предприятия по добыче и переработке радия территории, позволят существенно расширить представления о механизмах адаптации живых организмов к хроническому генотоксическо-му воздействию. Целью представленного исследования является оценка спонтанного уровня и скорости репарации индуцированных повреждений ДНК у дождевых червей семейства Ьыт-Ьricidae из популяций, в течение многих поколений заселяющих территории с фоновым и техногенно повышенным содержанием в почвах
тяжелых естественных радионуклидов (ТЕРН) и тяжелых металлов (ТМ).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
Экспериментальные участки. Экспериментальные участки расположены в окрестностях пос. Водный (Республика Коми). Район проведения исследований относится к подзоне северной тайги, охватывает бассейн нижнего течения р. Ухты. Почвы экспериментальных участков содержат фоновые и повышенные концентрации естественных радионуклидов земного происхождения и тяжелых металлов. Загрязнение обусловлено деятельностью предприятия по добыче и переработке радия в период с 1931 по 1956 г. [10]. Участок 1 расположен на территории бывшего радиохимического завода в пойме рек Чуть и Ухта, участок 2 — на территории необорудованного хранилища радиоактивных отходов на левом берегу р. Ухты. Контрольный участок находится на левом берегу р. Ухты в четырех километрах выше по течению от хранилища радиоактивных отходов.
Объект исследований. Для исследования были собраны половозрелые дождевые черви двух видов, обычных для исследуемой территории, но относящихся к разным жизненным формам почвенных беспозвоночных [11]. Lumbricus rubellus Hoff., встречающийся в пределах всей таежной зоны, относится к группе почвенно-подстилоч-ных червей [12], космополитный вид Aporrectodea caliginosa Savigny — к группе собственно почвенных животных [12]. Червей вручную выбирали из субстрата и транспортировали в лабораторию в контейнерах, заполненных почвой с места отбора пробы. Сразу после доставки образцов беспозвоночные были разделены на две группы: животные первой были зафиксированы в жидком азоте, второй — облучены в дозе 4 Гр от источника 137Cs и зафиксированы в жидком азоте через 1, 5, 30, 60 и 240 мин после окончания воздействия. Замороженные образцы хранили при температуре — 80°С.
Анализ содержания радионуклидов и тяжелых металлов в почве. Для определения содержания токсичных химических элементов на исследуемых площадках отбирали образцы почв методом "конверта" с глубины 0—20 см [13, 14]. Анализ ка-тионно-анионного состава почв, в том числе химических элементов I (Hg, Cd, Pb, Zn, As) и II (Cu, Ni, Cr, Co) классов опасности проводили в лаборатории "Экоаналит" (Аттестат аккредитации РОСС RU.0001.511257 от 16.04.2009) Института биологии Коми НЦ УрО РАН. Основные до-зообразующие радионуклиды (238U,230Th,226Ra, 210Po, 210Pb, 232Th,228Th) в образцах почв определяли в лаборатории миграции радионуклидов и радиохимии Института биологии Коми НЦ УрО
РАН (аттестат аккредитации № CAPK RU.0001.441623).
Для характеристики экологического состояния исследуемой территории по степени комплексного загрязнения почв химическими элементами различных классов опасности рассчитывали суммарный показатель загрязнения (Zc) ландшафтов на основе данных о содержании ТМ в образцах почв [15]:
n
Zc = £ Ki - (n - 1),
i = 1
где К — коэффициент концентрации, равный отношению концентрации c¡ i-го химического элемента в почве загрязненных участков к фоновому
f Ci
значению ci(bg): K =-; n — число включенных в
ci(bg)
расчет химических элементов, концентрации которых на загрязненных площадках достоверно (р < 0.05) превышают региональные фоновые показатели.
Для оценки воздействия тяжелых естественных радионуклидов на дождевых червей рассчитывали мощность взвешенной поглощенной дозы для почвенных беспозвоночных исследуемых участков от природных изотопов семейств 238U и 232Th с использованием программы ERICA Tool
[16] на основе значений удельных активностей радионуклидов в почве и предложенных в работе
[17] коэффициентов накопления.
Также для характеристики радиационной обстановки на участках дозиметром ДКГ-02У "Арбитр" (ООО НПП "Доза") измеряли мощность амбиентного эквивалента дозы у-излучения в воздухе на высоте 1м от поверхности почвы.
Секвенирование фрагмента последовательности гена митохондриальной цитохром-оксидазы I. Тотальную ДНК выделяли с помощью набора "Fast DNA Spin Kit" (QBioGene, Канада) по протоколу производителя. Амплификацию фрагмента проводили при помощи ПЦР смеси Screen Mix ("Евроген", Россия) с использованием прайме-ров к фрагменту последовательности гена первой субъединицы митохондриальной цитохромокси-дазы (COI): HCO2198 5'-TAAACTTCAGGGT-GACCAAAAAATCA-3' и LCO 5'-GGTCAA-CAAATCATAAAGATATTGG-3'. Режим амплификации: предварительная денатурация — 5 мин при 95°С, 40 циклов: денатурация — 15 с при 95°С, отжиг — 90 с при 50°С, элонгация — 90 с при 72°C; финальная элонгация — 5 мин при 72°С. Продукты амплификации разделяли методом электрофореза в агарозном геле, окрашивали бромистым этидием. Очистку ПЦР-продукта осуществляли с помощью набора QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Германия). Количество выделенной
А
)
Рис. 1. Целомоциты разных типов, переходящие в суспензию при грубом измельчении первых пяти сегментов дождевого червя (окрашивание по методу Романовского—Гимза, увеличение х1250) (А), и изображения "ДНК-комет", полученные с использованием данной суспензии (окраска бромистым этидием, увеличение х200) (Б).
ДНК и ПЦР-продукта определяли на анализаторе жидкости "Флюорат-02-Панорама" (ООО "Люм-экс", Россия). Секвенирование проводили с использованием набора реагентов ABI Prism BigDye Terminator v. 1.1 на приборе ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США).
Для обработки и анализа последовательностей применяли пакет программ MEGA версия 5. Выравнивание осуществляли при помощи программы ClustalW, входящей в данный пакет программ, и корректировали вручную. Для построения филогенетических деревьев были использованы методы объединения ближайших соседей (NJ) и максимальной парсимонии (MP). В качестве модели замен использовали модель Джукса-Канто-ра, а для оценки статистической достоверности устойчивости дерева — бутстрэп-индекс (1000 репликаций).
Анализ уровня повреждений и репарации ДНК
Приготовление суспензии клеток. Уровень спонтанных повреждений ДНК в клетках дождевых червей оценивали с помощью щелочной и нейтральной версий метода ДНК-комет, а динамику репарации ДНК регистрировали только для щелочного варианта [18]. Первые пять сегментов червя измельчали с помощью ножниц в центрифужной микропробирке в 200 мкл фосфатно-со-левого буфера (PBS; pH 7.4), содержащего 5 ммоль/л ЭДТА. В результате измельчения образовывалась гет
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.