ОНТОГЕНЕЗ, 2007, том 38, № 2, с. 105-119
ПРОЛИФЕРАЦИЯ И ИММОРТАЛИЗАЦИЯ
УДК 576.312.6
УСИЛЕНИЕ КОНТРОЛЯ ПРОЛИФЕРАЦИИ В ТЕЛОМЕРИЗОВАННЫХ
КЛЕТКАХ*
© 2007 г. Е. Е. Егоров1, М. В. Молдавер1, X. С. Вишнякова1, С. М. Терехов2, Э. Б. Дашинимаев3, И. Б. Чеглаков4, И. Ю. Торопыгин4, К. Н. Ярыгин4,
П. М. Чумаков1, |Л. И. Корочкин|5, Г. А. Антонова5, Е. Ю. Рыбалкина6, И. Н. Сабурина5, Н. С. Бурнаевский3, А. В. Зеленин1
1 Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгелъгардта РАН 119991 Москва, ГСП-1, ул. Вавилова, д. 32
2 Медико-генетический научный центр РАМН
115478 Москва, ул. Москворечъе, д. 1
3 Московский физико-технический институт
141700 Долгопрудный, Московская обл., Институтский пер., д. 9 f Научно-исследователъский институт биомедицинской химии им. В Н. Ореховича 119992 Москва, ул. Погодинская, д. 10
5 Институт биологии гена РАН 119334 Москва, ул. Вавилова, д. 34/5 6 Всероссийский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН 115478 Москва, Каширское шоссе, д. 24 E-mail: yegorov@eimb.ru Поступила в редакцию 07.02.06 г.
Ранее получены клоны теломеризованных фибробластов кожи взрослого человека. Показано, что, несмотря на быстрый рост в массовой культуре, эти клетки плохо образуют колонии. Кондиционированная среда, антиоксиданты и снижение парциального давления кислорода усиливают их коло-ниеобразование, но не до уровня, характерного для исходных клеток. При этом оказалось, что кондиционированная среда от теломеризованных клеток усиливает колониеобразование существенно сильнее, чем таковая от исходных клеток. Исследование протеома теломеризованных фибробластов в настоящей работе показало изменение в действии десятков генов. Общая тенденция состоит в ослаблении и повышенной лабильности цитоскелета и активации механизмов, контролирующих деградацию белков. Однако эти изменения не носят сильно выраженный характер. Установлено, что в процессе образования иммортальных теломеризованных клеток происходит отбор, который, вероятно, обусловливает изменения экспрессии ряда генов. Высказано предположение о том, что снижение способности теломеризованных клеток к образованию колоний происходит из-за повышенных требований этих клеток к межклеточным контактам. Только в самых крупных колониях скорость роста клеток достигает таковой, характерной для массовой культуры. В этой связи тело-меризованные фибробласты напоминают стволовые клетки: они способны к самоподдержанию, но "сваливаются" в дифференцировку при отсутствии соответствующего микроокружения (ниши), которой являются другие фибробласты. Неделящиеся клетки в тесте колониеобразования следует рассматривать как дифференцированные, поскольку они не имеют признаков деградации, сохраняют свою жизнеспособность, активно перемещаются, растут, фагоцитируют дебрис и т.п. Мы показали также, что теломеризация не препятствует дифференцировке миобластов и нейральных стволовых клеток человека. Таким образом, все проведенные исследования свидетельствуют о существовании в теломеризованных клетках нормальных механизмов регуляции пролиферации, что открывает возможность их использования в клеточной терапии, особенно в случаях трансплантации аутологичных клеток пожилым людям, когда пролиферативный потенциал их клеток значительно снижается, а доступность стволовых клеток существенно ограничена.
Ключевые слова: теломеризация, иммортализация, теломераза, клетки человека, старение клеток, фибробласты, протеом, клеточная терапия, нейральные стволовые клетки, лентивирусы, колониеобразование.
*Работа поддержана Российским фоном фундаментальных исследований (проекты < 99-04-48073, 02-04-49196, 05-0449442), Программой по поддержке ведущих научных школ РФ (проекты НШ-1794.2003.4, НШ-20182003.4) и Программой фундаментальных исследований РАН "Стволовые клетки".
Есть серьезные основания полагать, что медицина будущего будет во многом основываться на клеточных технологиях. Благодаря достижениям медицины продолжительность жизни людей сильно превысила ту, которая была выработана в процессе естественного отбора. Поэтому ресурсы человеческого тела оказываются недостаточными для нормальной жизни в возрасте, превышающем таковой (до 40 лет) людей каменного века (Fossel , 2004). В процессе старения происходит гибель клеток организма, которая приводит к ослаблению функций органов и тканей, уменьшению их надежности и развитию болезней, связанных со старением. Помимо собственно старения любые болезни, в том числе специфические, связанные с прогрессивной потерей клеток, и травмы также приводят к уменьшению числа клеток. В 1998 г. было показано, что введение гена каталитического компонента теломеразы способно иммортализовать клетки человека, т.е. придать им способность проходить в культуре неограниченное число делений. Перспективным подходом, позволяющим получать достаточное для клеточ-но-заместительной терапии количество клеток, по нашему мнению, является временно экспрессия гена каталитического компонента теломеразы в клетках человека in vitro (Narushima et al., 2005). При этом теломераза удлиняет теломеры без генетической модификации клеток. Такая процедура позволяет нарастить необходимую клеточную массу и провести в случае надобности генно-инженерную коррекцию дефекта. Таким образом, клеточно-заместительные технологии могут оказаться необходимыми и для генной терапии. Возможно, что основные манипуляции по "лечению больных генов" будут производиться ex vivo, вне тела пациента с последующим введением клеток в его организм. Цель нашей работы -всестороннее изучение различных теломеризо-ванных клеток.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Клетки. Штаммы диплоидных фибробластов кожи взрослого человека № 1608, скелетных ми-областов человека № 1603 и эмбриональных фибробластов легкого человека № 1075 взяты из коллекции культур клеток МГНЦ РАМН. Клетки получены от нормальных доноров и имеют нормальный кариотип. Фибробласты выращивали в среде DMEM, а миобласты - в среде F-12 с добавлением 10% эмбриональной сыворотки теленка ("HyClone", США), 5% пуповинной сыворотки человека ("ПанЭко", Россия) и 40 ед/мл гентамицина.
Первичные культуры нейральных стволовых клеток (НСК) человека получены И.Н. Сабури-ной (Институт биологии гена РАН) из переднего отдела мозга эмбрионов человека (медицинских абортусов) в возрасте 6-11 нед. Мозг эмбриона
человека измельчали, обрабатывали растворами трипсина и версена, пипетировали и переносили в культуральную среду. Клетки культивировали в монослойной культуре в пластиковых культу-ральных флаконах Í25 ("Costar", США) в среде DMEM-F-12 с добавлением 3% эмбриональной телячьей сыворотки; по 10 нг/мл ростовых факторов FGF-2 и EGF; 0.11 мг/мл пирувата натрия; 0.32 мг/мл глутамина и 40 ед/мл гентамицина. Пересев клеток осуществляли после образования монослоя при помощи растворов версена и смеси трипсин-версен (1 : 1). На ранней стадии культивирования (2-й пассаж) в клетки при помощи лен-тивирусной конструкции вводили ген каталитического компонента теломеразы человека (lenti-hTERT).
Долю апоптозных и митотических клеток подсчитывали с помощью инвертированного фазо-во-контрастного микроскопа Diaphot ("Nikon", Япония). Апоптозными считали такие фибробласты, которые потеряли свою распластанность, округлились и имели ядро неправильной формы.
Введение гена hTERT в клетки человека с помощью плазмиды. Плазмида p190, содержащая полную последовательность гена hTERT под контролем цитомегаловирусного (CMV) промото-ра/энхансера в векторе pCI-neo ("Promega", США), создана в лаборатории проф. Р. Вайнбер-га, США (Whitehead Institute of Biomedical Research) и любезно предоставлена проф. П. Донини (Римский университет, Италия). В состав плазмиды входит ген неомицин фосфотрансферазы, ответственный за устойчивость к антибиотику G-418. В качестве контроля использовали введение плазмиды pCIneo. Трансфекцию осуществляли с помощью электропорации (Electro Cell Manipulator BTX, США).
Получение препаратов инфекционных реком-бинантных лентивирусных частиц. кДНК гена hTERT человека, включающая полную кодирующую область (Meyerson et al., 1997), была клонирована под промотором CMV в лентивирусный вектор pLU-PL3 (Sablina et al., 2005). Для упаковки векторных псевдовирусных частиц ДНК лентиви-русного вектора вводили в клетки 293Т (DuBridge et al., 1987; Pear et al., 1993) одновременно с двумя упаковочными плазмидами - pCMV-deltaR8.2 (Dull et al., 1998) (экспрессирует белок gag и обратную транскриптазу вируса HIV) и pVSV-G (Naldini et al., 1996) (экспрессирует белок G вируса везикулярного стоматита). Три плазмиды смешивали в равной пропорции и вводили в клетки методом липофекции с помощью системы Lipo-fectamine-plus по протоколу, рекомендованному производителем ("Invitrogen", США). Сбор вирусных частиц производили начиная с 48 ч после трансфекции каждые 8 ч в течение 3 сут. Сразу после отбора вирусосодержащих супернатантов
их помещали на лед и добавляли 10% (объемных) ПЭГ-8000 ("Sigma", США). После завершения сбора вируса преципитаты вирусных частиц, образовавшиеся при высаживании ПЭГ, осаждали низкоскоростным центрифугированием (5 тыс. об/мин, 10 мин) и суспендировали в 1/20 от исходного объема супернатанта свежей среды DMEM с добавлением 5% эмбриональной телячьей сыворотки. Препарат разделяли на аликво-ты и хранили при температуре -70°С.
Введение гена hTERT в клетки человека с помощью лентивирусного вектора. Введение генов можно осуществлять как в растущие культуры, так и в неделящиеся клетки. Для увеличения доли трансфицированных клеток рекомендуется уменьшать количество клеток и повышать титр вируса. Обычно титр неконцентрированного вируса составляет примерно 3-5 х 106/мл. После удаления ростовой среды к растущим во флаконах Т25 клеткам на стадии половины монослоя добавляли вирусный концентрат (1 мл с титром 108/мл), разведенный полной ростовой средой с сывороткой в соотношении 1 : 2. Эта смесь содержала также 5 мкг/мл полибрена. Клетки инкубировали в течение ночи, после чего среду меняли на обычную. Экспрессия гена развивалась медленно в течение 3-4 сут. Эффективность ленти-вирусной трансфекции (по параллельному введению гена
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.