ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2007, том 54, № 6, с. 920-925
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
УДК 581.1
УСОВЕРШЕНСТВОВАННЫЙ МЕТОД ИДЕНТИФИКАЦИИ САЙТА ВСТАВКИ Т-ДНК В ГЕНОМЕ ТРАНСГЕННОГО РАСТЕНИЯ
Arabidopsis thaliana
© 2007 г. С. Ч. Хуан, X. Ц. Лиу, Г. X. Хе, Ф. Г. Ю
Колледж биологии, Нанкинский университет, Нанкин, Китай Поступила в редакцию 19.09.2006 г.
В работе представлен усовершенствованный метод идентификации сайта вставки Т-ДНК в геном трансгенного растения Arabidopsis thaliana (экотип Columbia). С помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) из плазмиды pLASC11.12.8 амплифицировали преадаптор и путем его расщепления с помощью фермента HindIII получили адаптор. После обработки щелочной фосфатазой из кишечника теленка адаптор лигировали с фрагментом расщепленной с помощью той же эндо-нуклеазы геномной ДНК. Затем проводили два этапа ПЦР (nested-ПЦР) и амплифицировали неизвестную последовательность, расположенную между Т-ДНК и адаптором. Дальнейший анализ был направлен на определение точной локализации сайта вставки Т-ДНК в геноме трансгенного растения A. thaliana.
Ключевые слова: Arabidopsis thaliana - локализация Т-ДНК - адаптор - nested-ПЦР.
введение
Во время опосредованной Agrobacterium трансформации ДНК вставка Т-ДНК происходит случайным образом. Т-ДНК может интегрироваться в любую хромосому или любой локус генома растений [1-3]. Традиционным методом идентификации интеграции чужеродной ДНК является гибридизация по Саузерну [4], однако она не позволяет выявить точную локализацию сайта вставки чужеродной ДНК в геноме хозяина. К тому же, требуется много времени для определения числа копий Т-ДНК. В настоящее время для этих целей применяются методы, основанные на полимеразной цепной реакции (ПЦР), такие как обратная ПЦР [5-8], опосредованная лигированием ПЦР [9-13] и ПЦР со случайными праймерами [14-16]. Эти методы являются более информативными и могут служить альтернативой блотированию геномной ДНК.
Мы частично модифицировали метод Zhou и др. [11] и нашли упрощенный и эффективный способ обнаружения последовательности ДНК, граничащей со вставкой Т-ДНК (рис. 1). Преадаптор амплифицировали с помощью ПЦР из плазмиды pLASC11.12.8, и после его расщепления
Сокращения: EtBr - этидий бромид, ПЦР - полимеразная цепная реакция; Т-ДНК - транспортная ДНК. Адрес для корреспонденции: Dr. S.C. Huang. College of Life Science, Nanjing University, Hankou Road 22, Nanjing, 210093, China. Fax: 86-25-83592705; e-mail: fugen@nju.edu.cn
HindIII получали адаптор. После обработки щелочной фосфатазой из кишечника теленка адаптор лигировали с фрагментом расщепленной с помощью той же эндонуклеазы геномной ДНК. Затем проводили два этапа ПЦР (nested-ПЦР), т.е. амплификацию в два этапа с внутренними праймерами, тем самым амплифицировали неизвестную последовательность, расположенную между правой и левой границами Т-ДНК и адаптором. Продукты ПЦР разделяли в 1.5%-ном ага-розном геле с красителем бромистым этидием (EtBr) и выбирали полосы для секвенирования. Анализ последовательности ДНК проводили с использованием программы BLAST (http://ncbi.nlm. nih.gov).
методика
Растительный материал и условия выращивания. Трансгенные растения Arabidopsis thaliana получали в условиях нашей лаборатории путем агробактериальной трансформации. Использовали Ti-плазмиду pER8, любезно предоставленную проф. Nam-Hai Chua (лаборатория молекулярной биологии растений, Рокфеллерский университет, США). В соответствии с [18] для выделения ДНК выбирали трансгенные растения линий 4-6, 10-9 и 8-2. Концентрацию ДНК определяли при длине волны 260 нм при помощи Biophotometer 6131 ("Eppendorf", Германия).
Рестрикция геномной ДНК. 3 мкг геномной ДНК расщепляли путем инкубации с 3 мкл HindIII
усовершенствованный метод идентификации сайта вставки т-днк
921
праимер ИтШ
преадаптор
праИмер 2 ПЦР
место встраивания геномная ДНК Т-ДНК
ИтШ
ИшёШ
И1н&т адаптор
ч ч
геномная ДНК
а1 а2
а1 а2
Амплификация методом nested-ПЦР
Секвенирование
Рис. 1. Процедура проведения ПЦР (nested-ПЦР) для идентификации саИта вставки Т-ДНК в трансгенное растение А. ^аНапа.
Для получения преадаптора в качестве матрицы для ПЦР использовали плазмиду. После расщепления ферментом ИМШ и дефосфорилирования адаптор лигировали с сегментом рестрикции ДНК растения с помощью Т4 ДНК лига-зык Лигированные фрагменты амплифицировали методом ПЦР с использованием праИмеров а1 и Ь1. Продукты ПЦР вновь амплифицировали с использованием праИмеров а2 и Ь2 (праИмеры а1 и а2 были специфичны соответствующему адаптору, а праИмеры Ь1 и Ь2 - соответствующеИ Т-ДНК). Амплификация возможна только для фрагмента ДНК, расположенного между праИмером, специфичным для адаптора, и праИмером, специфичным для Т-ДНК. Фрагменты, не имевшие вставки Т-ДНК, не могли амплифицироваться. Продукты ПЦР разделяли в 1.5%-ном агарозном геле с целью последующего секвенирования.
(15 ед./мкл, "TaKaRa", Япония) в конечном объеме 50 мкл в течение ночи при 37°С. Смесь экстрагировали равным объемом смеси хлороформ : : изоамиловыИ спирт (24 : 1 по объему). ДНК осаждали путем добавления двух объемов охлажденного абсолютного этанола и 1/10 объема раствора ацетата натрия (3 М, рН 5.2) и оставляли при -20°С на 1 ч. Осадок дважды промывали 70%-ным этанолом и высушивали на воздухе. СухоИ осадок ресуспендировали в 30 мкл бидистиллята и изме-
ряли концентрацию ДНК с помощью Biophotome-teг 6131.
Приготовление адаптора. Сначала получали преадаптор. Для амплификации последовательности ДНК длиноИ 956 п.н., содержавшеИ локус рестрикции ферментом ИМШ, использовали два специфических праИмера: праИмер 1 (5'-ТААА-GATACCCCAAGAAGC-3') и праИмер 2 (5'-Пда-GTTTACCCGCCAAT-3').
п.н.
2000
1000 750
500
250
Рис. 2. Получение преадаптора и адаптора. М - маркер молекулярной массы ДНК; a - продукты амплификации преадаптора методом ПЦР; b - после расщепления преадаптора ферментом Hindlll больший фрагмент (551 п.н.) являлся требуемым адаптором.
В 20 мкл смеси образца для ПЦР входили 1 мкл взвеси бактерий в качестве матрицы, по 2 мкл каждого праймера (2 мкМ), 1.6 мкл смеси дАТФ, дЦТФ, дГТФ и дТТФ (концентрация каждого -2.5 мМ), 1.2 мкл MgCl2 (25 мМ ), 2 мкл 10-кратного буфера для ПЦР, 0.2 мкл Taq ДНК полимеразы (5 ед./мкл, "TIANGEN", Китай) и бидистиллят до конечного объема. ПЦР инициировали нагреванием смеси при 94°С в течение 5 мин, далее следовали 30 циклов амплификации при 94°С в течение 30 с и при 45°С в течение 40 с, завершала реакцию элонгация при 72°С в течение 10 мин. 3 мкл продуктов ПЦР разделяли с помощью электрофореза в 1.5%-ном агарозном геле.
Далее изготовляли адаптор: 25 мкл продуктов ПЦР, полученных как описано выше, расщепляли путем инкубации с 45 ед. Hindlll (15 ед./мкл) в 50 мкл реакционной смеси при 37°С. После нагревания при 65°С в течение 15 мин добавляли 2 мкл щелочной фосфатазы из кишечника теленка (1 ед./мкл, "Sangon", Китай) до конечного объема
60 мкл, и смесь выдерживали при 37°С в течение 30 мин. Далее продукты разделяли с помощью электрофореза в 1.5%-ном агарозном геле с красителем EtBr, фрагменты ДНК выделяли с помощью набора AxyPrep™ DNA gel extraction kit ("Axygen Scientific", США). Концентрацию адаптора измеряли с помощью Biophotometer 6131.
Лигирование. 0.2 мкг расщепленной геномной ДНК лигировали с 0.08 мкг адаптора с помощью 1 мкл Т4 ДНК лигазы (10 ед./мкл, "TaKaRa") в конечном объеме 10 мкл. Реакцию проводили в течение ночи при 16°С. Лигирующую смесь разводили бидистиллятом в соотношении 1 : 500 и готовили следующую матрицу для ПЦР.
Амплификация лигированных фрагментов ДНК с помощью ПЦР. пЦр (nested-ПЦР) выполняли в два этапа. На первом этапе использовали образец объемом 20 мкл, содержавший 1 мкл лигированных фрагментов ДНК в качестве матрицы, по 2 мкл каждого праймера (2 мкМ), 1.6 мкл смеси динуклеотидтрифосфатов (концентрация каждого 2.5 мМ), 1.2 мкл MgCl2 (25 мМ), 2 мкл 10-кратного буфера для ПЦР и 0.2 мкл Taq ДНК полимеразы (5 ед./мкл, "TIANGEN"). В качестве праймеров использовали следующие последовательности: 5'-GCTTAGTTGCCGTTCTTCCG-3' и 5'-TAATCGCCTTGCAGCACATC-3' (a1 и b1 на рис. 1). ПЦР проводили по следующей программе: 5 мин при 94°С с целью начальной денатурации, 30 циклов: 94°С в течение 30 с, 50°С в течение 40 с и 72°С в течение 3 мин, в завершение -элонгация при 72°С в течение 10 мин.
На втором этапе в качестве матрицы использовали ПЦР-продукты первого этапа, а в качестве праймеров - последовательности 5'-GGACT-GATGGGCTGCCTGTA-3' и 5'-GCTGGCGTAAT-AGCGAAGAG-3' (a2 и b2 на рис. 1), которые могут специфически гибридизоваться с продуктами ПЦР первого этапа. Условия и программа ПЦР были аналогичны таковым на первом этапе.
Секвенирование продуктов ПЦР. Продукты ПЦР (nested-ПЦР) разделяли в 1.5%-ном агарозном геле с красителем EtBr. Нас интересовали полосы размером более 400 п.н., которые секвени-ровали в Нанкинском университете.
результаты
Приготовление преадаптора и адаптора
Для синтеза преадаптора изготовили пару специфических праймеров. В нашем эксперименте преадаптор имел длину 956 п.н. Продукты его рестрикции ферментом HindIII (551 п.н. и 405 п.н.) хорошо разделялись в 1.5%-ном агарозном геле с красителем EtBr (рис. 2).
усовершенствованный метод идентификации сайта вставки т-днк
923
п.н.
5
2
2000
1000 750
500 250
Рис. 3. Амплификация лигированных продуктов методом ПЦР.
М - маркер молекулярной массы ДНК; а - фрагмент ДНК растения линии 8-2 - продукт ПЦР длиной 250 п.н., нас не интересующий, так как его размер менее 400 п.н.; Ь - фрагменты ДНК растения линии 10-9 -продукты ПЦР размером 750 п.н. и 1100 п.н.; с - фрагмент ДНК растения линии 4-6 - продукт ПЦР размером 720 п.н.
Амплификация с помощью ПЦР лигированных фрагментов ДНК
Первый этап амплификации не привел к появлению видимых полос, соответствующих фрагментам ДНК, при их разделении в агарозном геле, так как число копий лигированных фрагментов ДНК было слишком мало. Поэтому на втором этапе применяли метод ПЦР с праймера-ми на последовательность внутри ампликона (рис. 3).
Секвенирование и анализ продуктов ПЦР (nested-ПЦР)
Очищенные продукты ПЦР после амп
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.