Байкал, эвтрофного озера Кротовая Ляга в Новосибирской области, малых рек в черте города Новосибирска, а также образцов почвы, взятых в заболоченных северных районах нефтедобычи и др. Штаммы депонированы в Коллекции микроорганизмов ГНЦ ВБ "Вектор".
Идентификация чистых культур нефтеде-структоров. Изучение морфологии, физиологических, биохимических свойств и др. проводили стандартными методами [15, 16] с помощью системы "Microlog" ("Biolog", США) и по результатам секвенирования ДНК, выделенной при использовании набора реактивов Quagen (США). Амплификацию ДНК проводили на приборе 3100 Genetic Analyzer ABI PRISM ("Applied Biosystems", США). Цикл включал 25 реакций по следующей программе: 96°С в течение 10 с, 50°С в течение 5 с, 60°С в течение 4 мин. Для проведения ПЦР использовали 1.5 мкл ДНК, 2 мкл 27 F праймера, 2 мкл 1492 R праймера, 44.5 мкл смеси ферментов, буфера, нуклеотидов (общий объем 50 мкл). Анализ результатов секвенирования проводили с помощью базы данных NCBI Blast.
При наработке биомассы штаммов в качестве источника углерода к среде 8Е добавляли глюкозу (1%); для определения способности к окислению углеводородов - сырую нефть или нефтепродукты, добавленные по весу (1-2%). Начальная концентрация клеток в опытных колбах составляла в среднем 1 х 107 кл./мл. Инкубирование проводили в течение 7-25 сут при 4-6° и 22-24°С без дополнительной аэрации и с аэрацией, используя тер-мостатируемую качалку ("Sanyo", Япония; "Orbisafe", Великобритания) со скоростью вращения 200 об/мин.
Устойчивость микроорганизмов к высокой концентрации соли. Штаммы микроорганизмов высевали на агаризованные и в жидкие питательные среды с различным содержанием NaCl (5.0, 7.0, 10.0%).
Определение содержания н-алканов. Использовали метод капиллярной газовой хроматографии. Пробу культуральной жидкости после окончания эксперимента количественно переносили в делительную воронку объемом 250 мл, экстрагировали хлороформом (2 х 50, 2 х 40, 1 х 10 мл). Хлороформные экстракты объединяли, упаривали на ротационном испарителе при 30°С, количественно переносили в мерную колбу объемом 50 мл, содержимое колбы доводили до метки хлороформом. Полученный образец использовали для анализа. Хроматографический анализ выполняли на приборе модели 3600 ("VARIAN Associates", Inc., США), оснащенном колонкой J&W Scientific DB-5, 30 м х 0.22 мм, инжектором с делением потока, пламенно-ионизационным детектором, системой регистрации и обработки хроматографических данных (ChromStar, "Bruker", Германия). В ходе
анализа программировали изменение температуры колонки: 50°C - 2 мин, 50 - 320°C - 15Х/мин, 320°C - 5 мин. Температура инжектора - 320°С, детектора - 335°С. Отнесение хроматографических пиков н-алканов на хроматограммах экстрактов выполняли по времени удерживания с использованием калибровочного образца (Boiling Point Calibration Sample #1, "ULTRA Scientific, Inc.", США). Величину утилизации н-алкана (в процентах) определяли, как разность площадей его пиков на хроматограммах экстрактов проб без добавления деструкторов (контроль) и после деструкции [17-19].
Выращивание растений в нефтезагрязненной почве. Для исследований были использованы контейнеры с почвой. В опытные варианты контейнеров (В-1, В-2) вносили нефть до 2%. Затем в почву варианта В-1 добавляли суспензию нефте-утилизирующего штамма дрожжей NF5-1 до концентрации 1 х 105 кл./см3. Третий контрольный вариант (К) контейнеров содержал почву без нефти и биодеструктора. Все варианты опыта и контроля выдерживали в течение 25 сут при комнатной температуре и влажности грунта 50-60%, после чего в них были внесены семена огурцов и гороха. Наблюдения за проростками в опытах проводили в течение 2 мес, проведено 3 серии опытов.
Численность и соотношение клеток штаммов.
Определяли микроскопированием клеточных суспензий на разных этапах культивирования методом фазового контраста [15], высевом на агаризованные среды для получения изолированных колоний с дальнейшим их подсчетом и идентификацией. При оценке как индивидуальной активности штаммов, так и в ассоциациях, учитывали изменение оптической плотности культуральной жидкости при инкубировании штаммов, характер и скорость биоэмульгации.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Выделение штаммов-деструкторов. В ходе исследования из природных субстратов Сибири выделено более 100 мезофильных и психротоле-рантных штаммов, обладающих хорошим ростом на среде 8Е с нефтью. Проведен их отбор на неф-теокисляющую способность при 4-6 и 22-24°С инкубирования. Полученные штаммы-нефтеде-структоры были идентифицированы как представители родов Yarrowia, Arthrobacter, Bacillus, Pseudomonas, Rhodococcus, Mycobacterium, Actinomyces, Nocardia и др. Штаммы утилизировали нефть с разной эффективностью при различных условиях. Отличительной чертой значительной части штаммов коллекции является способность к росту и деструкции нефтепродуктов при пониженных температурах.
Плотность и химический состав нефти разных месторождений Сибири
Месторождение Плотность р4, г/см3 Содержание, %
сера парафины смолы асфальтены фракции до 200°С фракции до 300°С
Западно-Салымское 0.860 0.51 3.62 4.85 1.06 20.00 53.00
Романовское 0.890 0.40 3.57 6.52 0.88 15.50 37.00
Сугмутское 0.860 0.46 2.45 4.58 0.25 19.50 43.00
Средне-Итурское 0.877 0.50 3.67 7.34 5.13 7.81 17.00
Муравленковское 0.850 0.40 3.69 6.07 1.23 12.03 22.50
Холмогорское 0.870 0.51 3.11 7.07 2.19 12.09 26.00
Утилизация нефти разных месторождений штаммами-деструкторами. Для исследованных психротолерантных штаммов, изолированных из грунтов Якутии, оценена степень деструкции восьми образцов нефти, отличающихся фракционным составом, из следующих месторождений: Муравленковское, Спорышевское, Сугмутское, Западно-Салымское, Меретояхинское, Холмогорское, Средне-Итурское, Романовское. Изучаемые штаммы в различной степени утилизировали исследованные образцы нефти. Испытуемые образцы нефти значительно отличались друг от друга физико-химическими свойствами - плотностью, вязкостью, фракционным составом, содержанием серы, парафинов, смол и асфальтенов (таблица). Наиболее активными были штаммы Ja 233p (на Муравленковской нефти), Ja 236р (на Холмогорской), Ja 613p (на Спорышевской, За-падно-Салымской, Холмогорской), Ja 291p (на Меретояхинской), Ja 283p (на Спорышевской, Романовской, Западно-Салымской). Штаммы психротолерантных микроорганизмов Arthrobacter sp. Ja 285p и Arthrobacter sp. Ja 269p утилизировали большинство из предложенных образцов нефти уже на 2 сут культивирования с газообразованием. В наименьшей мере подвергался деградации микроорганизмами образец нефти Средне-Итур-ского месторождения.
Наряду со штаммами, выделенными из Якутии, на нефтеокисляющую активность разных месторождений нефти был проверен штамм дрожжей NF 5-1. Выявлено, что этот штамм активно эмульгировал и утилизировал все исследованные образцы нефти. С помощью системы Microlog ("Biolog", США) и анализа результатов се-квенирования ДНК, согласно базе данных NCBI Blast, штамм дрожжей NF 5-1 определен, как вид Yarrowia lipolytica.
Применение ассоциаций микроорганизмов.
Проведенные исследования показали, что среди использованных нами различных сочетаний неф-теутилизирующих штаммов наиболее активными деструкторами н-алканов явились варианты ассоциаций: Bacillus sp. 282 и Arthrobacter sp. 283;
Pseudomonas sp. Bk-1 и Pseudomonas sp. Bk-2; Pseudomonas sp. El-5 и Mycobacterium sp. El-2; Bacillus sp. Alt-41 и Bacillus sp. Alt-43; штамм дрожжей Che-692 и Nocardia sp. Alt-4, Pseudomonas sp. KL-1 и Yarrowia lipolytica NF5-1, Pseudomonas sp. Bk-2 и Candida sp. Nb-2, Pseudomonas fluorescens NB-3 и Candida sp. Nb-2 и др. Процент деструкции н-алка-нов приведенными выше комбинациями культур составлял от 62.5 до 95% за 7 сут наблюдения.
Деструкция н-алканов ассоциацией, включающей в свой состав штаммы Pseudomonas sp. KL-1 и Yarrowia lipolytica NF5-1 (соотношение 1 : 1), исследована при 3 значениях рН среды (5.0, 7.0, 8.5) и разной концентрации соли (0.5, 5.0. 7.0% NaCl). При совместном использовании штаммов степень утилизации н-алканов при рН 7.0 достигала 92% (рис. 1), при рН 5.0-87%, а при рН 8.5-75% (рис. 2). Индивидуально используемые штаммы Pseudomonas sp. KL-1 и Yarrowia lipolytica NF5-1 утилизировали н-алканы с меньшей эффективностью в сравнении с применением их для деструкции нефти совместно.
Выяснено, что при повышенных концентрациях соли степень биодеструкции ассоциацией остается значительной: при 5% NaCl степень утилизации н-алканов достигает 78%, при 7% NaCl - 73% за 6 сут (рис. 3). Утилизация н-алканов при внесении только штамма Yarrowia lipolytica NF 5-1 без Pseudomonas sp. KL-1 составила 59% в среде с 10% NaCl. Ассоциация штаммов Pseudomonas sp. KL-1 и Yarrowia lipolytica NF5-1 также достаточно эффективно утилизировала образцы нефти, отличающиеся наличием большого количества тяжелых углеводородов (нефть Усинского месторождения). При температуре 23-25°С за 6 сут среднее значение утилизации н-алканов Усинской нефти также составляло около 92%, при пониженной температуре 4-6°С - 64% (рис. 4), в то время как деструкция н-алканов более легкой Западно-Са-лымской нефти при 4-6°С достигала 82%.
Оценка нефтезагрязненной почвы, очищенной с помощью биодеструкторов, для выращивания растений. Показано, что всхожесть семян, высеянных в нефтесодержащую почву, предвари-
mV 44
42
40
38
36
34
С28
32
20
40
60
80
100
120
140
мин
Рис. 1. Газовая хроматограмма хлороформного экстракта контрольного образца Западно-Салымской нефти без добавления деструкторов (1) и после биодеструкции ассоциацией штаммов Pseudomonas sp. KL-1 и Yarrowia lipolytica NF5-1 (2) в течение 6 сут инкубирования при 23°С и рН среды 7.0.
%
100 80 60 40 20
Л Л
□ I
□ II
□ III
1 2 3 4 5 6 7
9 10 11 12 13 14 15 16 1718 19 20 21 22 23
Рис. 2. Утилизация н-алканов Западно-Салымской нефти ассоциацией штаммов Yarrowia lipolytica NF 5-1 и Pseudomonas sp. KL-1 при разных значениях рН среды. I - рН 5.0, II - рН 7.0, III - рН 8.5. 1 - ундекан, 2 - додекан, 3 - тридекан, 4 - тетрадекан, 5 - пентадекан, 6 -гексадекан, 7
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.