ГЕНЕТИКА, 2012, том 48, № 11, с. 1328-1335
ГЕНЕТИКА ЖИВОТНЫХ
УДК 575.2.084:591.51:616.895.84
УВЕЛИЧЕНИЕ ДОЛИ "НЕРВНЫХ" ЖИВОТНЫХ В ХОДЕ СЕЛЕКЦИИ НА КАТАТОНИЮ: УЧАСТИЕ В КАТАТОНИЧЕСКИХ РЕАКЦИЯХ ЦЕНТРАЛЬНЫХ АДРЕНОРЕЦЕПТОРОВ © 2012 г. М. А. Рязанова, Т. Н. Игонина, Т. А. Алехина, О. И. Прокудина
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирск 630090 e-mail: alek@bionet.nsc.ru Поступила в редакцию 15.02.2012 г.
На большом селекционном материале была подтверждена идея Д.К. Беляева о роли отбора в возникновении новых поведенческих и нейрональных форм. Работа выполнена на крысах линии ГК (от слов "генетическая" и "кататония"), склонных к проявлению пассивно-оборонительных реакций каталептического застывания. На современном этапе селекции показано увеличение доли "нервных" крыс как по выраженности таких реакций, так и по их частоте. В этот же период селекции определено количество мРНК генов а1А- и а2А-адренорецепторов в мозге крыс линии ГК. Обнаружено снижение экспрессии гена а1А-адренорецептора в среднем и продолговатом мозге, а также повышение экспрессии гена а2А-адренорецептора в лобной коре. Высказано предположение, по которому выявленные изменения в экспрессии генов а-адренорецепторов могут быть обусловлены повышением доли "нервных" животных и могут внести свой вклад в реализацию акинетической компоненты поведения в линии ГК.
По концепции Д.К. Беляева отбор по поведению открывает новые возможности для увеличения наследственной изменчивости. При этом в основе вектора отбора лежат регуляторные системы, влияющие на различные генетически детерминированные реакции организма [1]. В ходе селекции поведенческая патология может предстать как набор таких реакций, которые в норме играют адаптивную роль, но из-за резкого снижения порога их проявления могут приобрести патогенное значение [2—4]. В процессе селекции мы снижали порог пассивно-оборонительной реакции застывания, пытаясь, таким образом, создать модель предрасположенности к каталепсии. Линию назвали "ГК" от инициалов слов "генетическая" и "каталепсия" [5]. Отбор начался со скрещивания крыс из аутбредного стока Вистар, склонных к спонтанной позе повисания на потолке клетки. Однако селекция на этот признак оказалась неэффективной, и процент таких животных в течение нескольких первых поколений снижался. Между тем в селектируемой группе появилось большое число крыс, у которых удавалось вызвать каталептическую позу, изображенную на рис. 1. Дальнейшую селекцию вели на повышение длительности и интенсивности такой позы. На современном этапе селекции для животных линии ГК характерно биполярное кататони-ческое поведение, т.е. наличие гиперкинетических и акинетических кататонических форм реагирования. Мы предполагаем, что эти две фенотипиче-
ские формы представляют проявления одного и того же генотипа [6—8]. В основе перехода с одной формы на другую лежит ответ нейрогормональ-ных систем, реагирующих в первую очередь на изменения внешних факторов.
Одна из таких систем — норадренергическая система мозга. По гипотезе Близарда область Голубого пятна мозга, входящая в эту систему, — основное место синтеза и запаса норадреналина, является районом, регулирующим эмоциональные реакции [9]. Препараты, имеющие в качестве мишени адре-норецепторы, используются в клинике при терапии депрессий и различных нарушений поведения [10, 11]. Кроме того, конечные эффекты норадре-налина зависят от плотности и функционального состояния этих рецепторов. Ранее было показано снижение норадреналина в ряде структур мозга у крыс ГК [12]. Однако исследований адренорецеп-торного звена не проводилось.
Целью настоящей работы было проследить направление вектора отбора по соотношению гиперкинетических и акинетических форм поведения на протяжении всего хода селекции линии ГК, а также исследовать экспрессию генов а1А- и а2А-адренорецепторов в мозге на современном этапе селекции кататонической линии.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Экспериментальные животные. Одну часть животных из аутбредной линии ГК (140 крыс) и по-
Рис. 1. Крысы линии ГК в состоянии каталепсии.
пуляции Вистар (70 крыс) в возрасте с 3—5 мес. использовали для проведения поведенческих тестов; другая часть инбредной линии ГК (6 крыс) и инбредной линии Вистар (WAG) (6 крыс) — для определения мРНК генов а1А- и а2А-адреноре-цепторов. Всего было взято в эксперименты 222 животных. Крыс перед тестированием содержали в отдельных клетках в комнате для содержания животных вивария ИЦиГ СО РАН при свободном доступе к воде и корму. Все опыты на крысах проведены в соответствии с порядком проведения процедур на животных согласно приказу № 755 от 12 августа 1977 г. и по международным рекомендациям (этический кодекс от 1985 г.).
Селекционный критерий. Тест на каталепсию проводили в соответствии с традиционным селекционным методом [5]: животному придавали вертикальное положение в углу клетки, осторожно приподнимая тело за передние лапки палочкой. Регистрировали время удержания приданной таким образом позы после того, как палочка была убрана. Крыс считали "каталептическими", если они удерживали подобную позу больше 10 с. Средние значения для крыс Вистар составляли 3— 7 с и их считали "некаталептиками". Также оценивали "нервные" реакции в ответ на проведение палочкой по прутьям клетки: 0 баллов — нет реакции, 1 балл — вздрагивание, 2 балла — метание по клетке.
Тест "на звонок". Для ранжирования "нервных" реакций, характерных для крыс линии ГК, был разработан тест с использованием звонка. Домашнюю клетку с животным выносили в отдельную комнату и подавали звуковой сигнал
(110 дб, 2 с). Реакции животных записывали на видеокамеру Panasonic. Оценку реакций проводили по балльной системе: 0 баллов — нет никакой реакции; 0.2 балла — поворот головой; 0.5 баллов — поворот всем телом; 1 балл — побежка, равная ширине клетки; 2 балла — побежка, равная длине клетки; 2.5 балла — побежка, равная по длине диагонали клетки; 3 балла — крыса выпрыгивает из клетки. Также оценивали время застывания крысы после звонка в сек.
Определение количества РНК методом ПЦР в реальном времени. Инбредных крыс линии ГК и WAG быстро декапитировали и забирали биологический материал. РНК из тканей крыс выделяли Три-реагентом "Molecular research center".
Примеси геномной ДНК удаляли обработкой дезоксирибонуклеазой I ("Promega", USA), после чего проводили повторную экстракцию смесью фенол/хлороформ и чистым хлороформом, а также осаждение этанолом. После центрифугирования осадок РНК растворяли в деионизованной воде. Качество выделенной РНК оценивали электрофорезом в 1%-ном агарозном геле, количество — по оптической плотности при 260 нм.
Для получения кДНК смешивали 3 мкг РНК и 0.25 нмоль "случайных" (random N9) праймеров-наномеров. Конечный раствор объемом 50 мкл содержал буфер для обратной транскрипции (20 мМ трис-HCl, pH 8.3, 10 мМ DTT, 100 мМ KCl, 5 мМ MgCl2), 500 М дезоксинуклеозидтри-фосфатов и 40 ед. обратной транскриптазы MoMLV (ЗАО "Биосан", Россия). Синтез кДНК проводили при 37°С 1 час, 42°С 30 мин, 50°С 10 мин. Фермент инактивировали прогревом смеси при 75°С
Таблица 1. Характеристика праймеров, используемых в ПЦР
Ген Последовательность праймеров Т °С отж Т °С Длина продукта, пн
Rpl30 F: 5'-ATGGTGGCTGCAAAGAAGAC-3' R: 5'-CAAAGCTGGACAGTTGTTGG-3' 64 83 165
а1А-АР F: 5'-TGCCATCTTTGAGATCCTG-3' R: 5'-GGTAGCTCACACCAATGTA-3' 64 87 143
а2А-АР F: 5'-TATGGGCTACTGGTACTTT-3' R: 5'-CCCACACAGTGACAATGAT-3' 63 90 191
5 мин. Для последующей ПЦР использовали 0.25—0.5 мкл полученной кДНК.
Полуколичественную оценку экспрессии мРНК генов а1А- и а2А-адренорецепторов проводили по отношению к экспрессии мРНК гена "домашнего хозяйства" RPL30 как внутреннего контроля полимеразной цепной реакции. В работе использовали амплификатор iCycler iQ4 RealTime PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories, США). Реакционная смесь объемом 20 мкл содержала буфер F2 для ПЦР ("Вектор-Бэст"), 5 мМ MgCl2, 0.2 мМ dNTPs, SYBR Green I ("Медиген", Россия) в разведении 1 : 20000, по 150 нМ прямого и обратного праймеров и 1 е.а. hot-Start поли-меразы ("Вектор-Бест", Россия). Реакцию проводили в следующих условиях: предварительный прогрев при 94°С — 1 мин; после этого следовали 45 циклов: денатурация при 94°С — 15 с, отжиг — 20 с (Тотж), элонгация при 72°С — 20 с, сбор данных по флуоресценции для Rpl30 при 83°С — 10 с, сбор данных по флуоресценции для целевых образцов (Трег) — 10 с. После окончания ПЦР снимали кривые плавления для контроля специфичности реакции.
Из полученных образцов кДНК для каждого органа делали "усредненный" раствор кДНК, который использовали для построения калибровочных кривых, по которым определяли относительный уровень кДНК для целевых генов и гена сравнения в образцах.
Праймеры, используемые для определения ад-ренорецепторов (табл. 1), были подобраны с использованием онлайн олигоанализатора с сайта: www.eu.idtdna.com и проверены в базе данных Blast (Basic Local Alignment Search Tool) на специфичность [13].
Статистическую обработку производили с использованием пакета программ "Stastistica 6.0". Различия по поведенческим параметрам оценивали по критерию Манна—Уитни. При сравнении двух групп использовали i-критерий Стьюдента. При сравнении тестов "на каталепсию" и "на звонок" использовали коэффициент ранговой корреляции Спирмена. Для анализа данных по экспрессии использовали i-критерий Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ
На рис. 1 показаны каталептические позы застывания у крыс линии ГК.
На рис. 2,а четко прослеживаются синхронные изменения долей застывающих животных линий ГК и Вистар с положительной корреляционной связью (г = 0.53). Следует напомнить, что застывающими считали только тех животных, у которых время неподвижности превосходило 10 с. Поскольку тестирование двух линий крыс ГК и Вистар проводили в одно и то же время, обнаруженная положительная корреляция свидетельствует о влиянии средовых факторов на проявление реакций застывания.
На рис. 2а, б показано снижение процента застывающих животных по сравнению с пиковым показа
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.